Protocolo de entrenamiento de resistencia y ensayos de funcionamiento de los longitudinales de Drosophila melanogaster

Summary

Se presenta el primer protocolo de entrenamiento de resistencia para una especie de modelo genéticos importantes, Drosophila melanogaster, Y resumen de varios ensayos para trazar las mejoras en la movilidad de formación siguiente.

Abstract

Uno de los problemas más apremiantes que enfrentan los investigadores médicos modernos es el repentino aumento de los niveles de obesidad, con el consiguiente aumento en los trastornos asociados, como diabetes y enfermedades cardiovasculares ^1-3. Un tema importante de la investigación sobre estos problemas de salud asociados con el papel de los ejercicios de resistencia como una intervención beneficiosa.

El ejercicio físico es una manera barata, no invasiva, con la intervención de varios resultados beneficiosos, incluyendo la reducción en el exceso de grasa corporal ^4, el aumento de sensibilidad a la insulina en el músculo esquelético ^5, el aumento de las respuestas anti-inflamatorias y antioxidantes ^6, y aumentar la capacidad contráctil de los cardiomiocitos ^7. Ejercicios de baja intensidad se sabe que aumenta la actividad mitocondrial y la biogénesis de los seres humanos y ratones ^8, con el coactivador transcripcional PGC1-α como un intermedio importante ^9,10.

Despíte la importancia del ejercicio como una herramienta para la lucha contra varios importantes relacionados con la edad las enfermedades, extensos estudios genéticos longitudinales se han visto obstaculizados por la falta de un protocolo de entrenamiento de resistencia para una especie de modelo de vida corta genéticos. La variedad de herramientas genéticas disponibles para su uso con Drosophila, junto con su mantenimiento en el corto tiempo de vida y de bajo costo, lo convierten en un modelo atractivo para estudiar más a fondo estos mecanismos genéticos. Con esto en mente, hemos desarrollado un nuevo aparato, conocido como la Torre de Poder, de gran escala de entrenamiento con ejercicios en la Drosophila melanogaster ^11. La torre de energía utiliza el comportamiento de las moscas instintiva geotaxis negativo para inducir repetidamente escalada rápida. Cada vez que los ascensores de la máquina, y luego desciende, la plataforma de las moscas, las moscas son inducidos a subir. Las moscas siguen respondiendo siempre y cuando la máquina está en funcionamiento o hasta que llegan a ser demasiado fatigado para responder. Así, el investigador puede utilizar esta máquina para proporcionar sla formación imultaneous a un gran número de moscas de edades similares e idénticas genéticamente. Además, se describen los ensayos asociados útiles para seguir el progreso longitudinal de cohortes de moscas durante el entrenamiento.

Protocol

1. Configuración de encendido y operación de la Torre

1. La torre de alimentación se coloca en una pieza rectangular de madera contrachapada que se sujeta a una tabla. Un 4,5 rpm engranaje del motor de Grainger se apoya en la parte superior de cuatro 2 "x6" juntas y un ¾ de pulgada de tablero contrachapado. El motor, un control de velocidad de CA / CC, un fusible, y un interruptor on / off están conectados juntos en una caja de unión.
2. Para enfriar el motor, un agujero de 3 pulgadas de diámetro se corta en una pieza vertical de media pulgada de madera contrachapada. Por un lado, un ventilador 3-pulgadas está unido a la madera contrachapada, y por el otro, un cilindro de diámetro de 3 pulgadas de metal se adjunta.
3. Un brazo a medida que gira con un rodillo montado en el extremo está conectado al motor. El motor y el brazo adjunto girar en una dirección hacia la derecha, empujando hacia abajo una parte de un stock de tubo doblado ¾ pulgada cuadrada que está unido a la madera contrachapada con una bisagra de la puerta. Una rueda está unido al lado superior del material del tubo por debajo de la plataforma para permitir que gire contra la plataforma que es directamente por encima de ella.
4. El brazo empuja hacia abajo en un extremo de la población de tubo y levanta el extremo opuesto, levantando una plataforma de dos niveles (Figura 1D). Cuando el rodillo en el brazo despeja el stock de tubo que permite que el brazo para volver a la posición inicial, dejando caer la plataforma hacia abajo (Figura 1F).
5. Las plataformas consisten en bastidores que se colocan en la parte superior de la madera contrachapada y se asegura con cuerdas elásticas que se enganchan en los ojos de los tornillos. Las plataformas se deslizan hacia arriba y hacia abajo a lo largo de correderas de cajón que se adjuntan a la madera contrachapada con los soportes.
6. Los viales se colocan en los bastidores y se asegura con una pantalla de malla cuadrada que se sujeta con cuerdas elásticas.
7. Un cojín de espuma de poliestireno se coloca debajo de la plataforma para amortiguar el choque de la gota.
8. La potencia del motor se ajusta de tal manera que un período de rotación completa es de 15 segundos de duración.

2. Protocolo de Ejercicio

1. Las moscas están alojados en una incubadora de 25 ° C con 50% de humedad y una luz de 12 horas / daRK ciclo. Tanto la práctica de ejercicio y la evaluación de la capacidad de ejercicio se llevan a cabo en un 25 ° C de temperatura controlada habitación.
2. Las moscas se recogen y la misma edad-dentro de 1-2 días el uno del otro. Un mínimo de 240 moscas es necesaria para el seguimiento longitudinal de geotaxis resistencia y negativa (escalada) capacidad, dos indicadores fisiológicos que reflejan los efectos del entrenamiento. Seguimiento longitudinal permite el aislamiento de los cambios inducidos en relación con los valores de partida para cada cohorte, sin efectos de confusión de la variación entre las cohortes. Moscas para experimentos adicionales se deben recoger, según sea necesario.
3. Después de la recolección, las moscas se dividen en 120 moscas experimentales, los cuales serán sometidos al régimen de ejercicio, y 120 el control de moscas, que no será ejercida. Las moscas se almacenan en frascos de 20 moscas cada uno. Los viales de moscas experimentales se tapan con Flugs firma de acetato de celulosa y los viales de control (no ejercitada) las moscas están conectados con un suave SPOtapones de ESN, que puede ser empujado hacia abajo para inmovilizar a las moscas, mientras que en la torre de energía. Esponja se utiliza para la inmovilización debido a que su tamaño adaptativo permite una fácil colocación en la parte inferior del vial. El material de esponja suave reduce las lesiones causadas por los Flugs más sólidas.
4. Las moscas de la torre de la energía se almacena y se ejerce en los frascos que contienen 5 ml de alimentos, lo que les proporciona un aterrizaje más suave que las moscas que se ejercen en los viales vacíos. Los alimentos se componen típicamente de 10% de sacarosa, 10% de levadura, y 2% de agar en agua, aunque no se observa moscas para comer a menudo durante el curso de una sesión de entrenamiento. Si los viales vacíos se utilizan durante el entrenamiento, el porcentaje de moscas que sufren lesiones aumenta drásticamente.
5. La torre de la energía se utiliza en un ambiente de temperatura controlada que se mantiene a 25 ° C. Moscas experimentales se colocan en la torre de la energía y el hecho de subir. Control de las moscas también se colocan en la torre de la energía, pero el tapón de esponja es Pushed abajo en el vial de aproximadamente 3 mm por encima de las moscas con el fin de limitar el movimiento. Este grupo sirve como un control para los efectos de la torre de la energía que no están relacionados con el ejercicio. A pesar de un cierto margen todavía existe para estas moscas para maniobrar, hemos observado repetidamente que las moscas en estas condiciones corren muy poco y no demostrar una respuesta fisiológica al ejercicio. También puede ser deseable incluir un grupo de control adicional que no se coloca en la torre de la energía en absoluto.
6. Las moscas se ejercen cinco días consecutivos cada semana, utilizando un programa de rampa (Figura 2). Durante una semana las moscas se ejercen durante 2 horas por sesión, dos por semana durante 2,5 horas por sesión, y de tres semanas durante 3 horas por sesión. Aunque otros regímenes se han probado, este protocolo produce resultados consistentes a través de genotipos y en condiciones divergentes. Este protocolo es, sin embargo, sujeto a una amplia gama de posibles variaciones que puedan adaptarse a un experimento en particular.

1. Hora a la fatiga durante el ejercicio de resistencia es un indicador útil para confirmar fisiológica y / o cuantificar la capacidad de ejercicio de una cohorte dada. Los ensayos de fatiga se puede realizar longitudinalmente en cohortes que serán utilizados en los experimentos de formación. Los ensayos pueden realizarse ya sea antes de la formación, después de la terminación del protocolo de entrenamiento, o ambos. Otros puntos de tiempo intermedios se pueden agregar si trazar el progreso incremental durante el entrenamiento que se desea. El ensayo de fatiga también puede ser utilizado para medir la resistencia al ejercicio como una respuesta a otros tratamientos que el protocolo de formación, tales como la alteración dieta (Figura 3B).
2. Los ensayos de fatiga se llevó a cabo en un día en la formación no está teniendo lugar. Tanto el moscas experimentales y de control se colocan en la torre de la energía en viales de 20 cada uno y el hecho de subir hasta que se agote. La fatiga es reconocida como la falta de respuesta a un estímulo negativo con la escalada geotaxis serconducta. Comportamiento a la fatiga se obtuvo mediante la observación visual.
3. Un vial de las moscas que se considera "fatigado", cuando 5 o menos las moscas son capaces de subir más de 2 pulgadas de cuatro caídas consecutivas. Viales fatigados se retiran de la torre de la energía, mientras que todavía está funcionando, y el momento del traslado se registra. Los tiempos de extracción se pueden representar como un histograma anidado, o como un "time-to-fracaso" trama. Un ejemplo de datos representados como un "time-to-fracaso" representación se muestra en la Figura 3B.
4. Los viales se controla a intervalos de 10 minutos para un máximo de 10 horas (Figura 3B).

4. El ejercicio, la edad y capacidad locomotora

1. Dado que este protocolo de entrenamiento se basa en el comportamiento inducido por correr, un ensayo principal para cuantificar los efectos del entrenamiento consiste en medir el cambio longitudinal en el promedio de la velocidad de carrera durante el entrenamiento. Durante el curso de formación, de 120 moscas cohortes de moscas ejercidos y no ejercitada se ponen a prueba a diario por su respuesta a una s geotaxis negativotimulus. La técnica descrita en ANILLO Gargano et al. (2005) se utiliza para medir la habilidad de las moscas subir ^12. En pocas palabras, esta técnica mide la altura promedio se incrementó un vial de moscas durante un tiempo determinado después de la inducción de la geotaxis negativos. La altura subió durante un tiempo definido es equivalente a la escalada de velocidad. Las mediciones se realizan antes de colocar las moscas en la máquina para el entrenamiento diario con el fin de evitar las complicaciones de la fatiga después de la carrera del día.
2. En nuestro protocolo estándar, las moscas se ejercen para un total de tres semanas y la capacidad de escalar es examinada por un total de cinco semanas: tres semanas durante el ejercicio de entrenamiento y dos semanas después de la cesación de ejercicio (Figura 2). Esto permite que el experimentador para trazar si los efectos del ejercicio sobre la movilidad persisten después de la interrupción del programa.
3. Cuatro fotografías de la actuación de cada cohorte ANILLO día se utilizan para el análisis de la capacidad de trepar. Seis viales se incluyen en cada fotografía. Negativo geotaxis es inducido, y el uso de una cámara temporizado, se toma una fotografía después de un número definido de segundos. Se suelen utilizar dos segundos, aunque esto puede variar dependiendo de las condiciones experimentales. Para cada fotografía, cada vial se divide en cuatro cuadrantes de la misma altura, y el software de procesamiento de imágenes se utiliza para asignar a cada mosca una puntuación basada en el cuadrante que dentro del periodo de tiempo asignado. Las moscas que suben hacia el cuadrante superior recibirá una puntuación de 4, las moscas en el cuadrante superior más cercana recibirá un 3, vuela en el cuadrante segundo más alto recibe un 2, y las moscas en el cuadrante más bajo recibirá un 1. Las moscas que no se suban fuera de la parte inferior del todo se les da una puntuación de 0.
4. Para todos los viales en una fotografía determinada, un "índice de la escalada" es generado por un promedio de las puntuaciones de todas las moscas de ese frasco. Cada vial de los índices de las cuatro fotografías se promedian para obtener un índice escalada final para ese día.
5. Todos los experimentos se llevan a cabo geotaxis negativos longitudinaldinally. Los resultados se normalizaron a la inicial de "pre-ejercicio" cuenta con el fin de reducir el efecto de la variación en la cohorte de capacidad para trepar y poner de relieve el cambio relativo longitudinal en la capacidad de escalar una cohorte como el resultado de la práctica de ejercicio. La puntuación inicial se determina por el promedio de los índices de los tres primeros días de escalada y se le asigna un valor de 1. Los ensayos posteriores se expresa entonces como un porcentaje del índice inicial.

5. Los resultados representativos

De tipo salvaje moscas responder a un protocolo de resistencia con una disminución relacionada con la edad disminución de la capacidad de trepar que persiste después de la final de la formación, tal como se refleja en los ensayos de ANILLO longitudinales a través de cinco semanas de edad (Figura 3). Esta disminución retardada en geotaxis negativos es una respuesta estándar fenotípica que puede servir como un control positivo para asegurar que la respuesta de tipo salvaje ejercicio se está produciendo normalmente. Este conjunto de datos se presenta como un ejemplo de cómo ella inducción de ejercicio por el programa de la torre de alimentación puede ser utilizado como una entrada de comportamiento. La capacidad de los diversos factores genéticos o ambientales que modulan este efecto puede ser evaluado.

A la inversa, la torre de alimentación también se puede utilizar como una salida en diversos diseños experimentales. Por ejemplo, el genotipo, la dieta, u otras condiciones pueden ser variadas. Entonces, el efecto de estas variaciones en la fisiología del ejercicio se puede probar mediante la Torre de Poder. Aquí, se muestra un ejemplo de este enfoque. Cuando vuela con un porcentaje variable de sacarosa en sus dietas se ensayaron para determinar el tiempo al contenido fatiga, sacarosa mayor correlación con una mayor capacidad de resistencia (Figura 3B).

Figura 1. Funcionamiento de la torre de la energía. (CA) El brazo motorizado doblada con rodillo adjunto gira en sentido horario hasta que entre en contacto con el tubo cuadrado doblado. (D, E) Labrazo empuja hacia abajo el tubo cuadrado doblado, haciendo que la plataforma que está cargado con los viales de moscas para levantar. (F) A medida que el brazo despeja el tubo se permite la plataforma a caer hacia abajo, forzando a las moscas para volver a la parte inferior de la vial.

Figura 2. Sugerido protocolo de ejercicio. Las moscas sometidas al protocolo de entrenamiento se realizan para ejercer durante cinco días a la semana en un período de tres semanas de largo régimen rampa que aumenta progresivamente la duración del ejercicio de las primeras 2 horas, 30 minutos cada semana. Análisis estándar se incluyen los ensayos de fatiga antes y después del programa de ejercicios y ensayos de los anillos de la semana 1 hasta la semana 5. Todos los ensayos se realizaron por duplicado en un número igual de moscas no ejercidas como un control negativo. Otras varias pruebas fisiológicas o bioquímicas puede llevarse a cabo según lo determinado por el investigador.

Figura 3. Los ejercicios de resistencia altera múltiples aspectos de la movilidad. (A) realiza ensayos ANILLO longitudinalmente a través de las edades en un solo par de hombres Y ¹ W ^67C23 cohortes. Emparejados por edad, genéticamente idénticos ejerce y no ejercidas control de las moscas se midieron todos los días para la velocidad media de escalada. Los resultados se expresan en términos de un índice de escalada que se normaliza a la altura media de escalada a través de los tres primeros días de la medición. Entrenados por el ejercicio mostraron una disminución de las moscas relacionada con la edad disminución de la capacidad geotaxis negativo en comparación con los hermanos de la misma edad no ejercitadas a través de las edades (2-way ANOVA, p <0,005). (B) los ensayos de fatiga a cabo durante 8 horas en emparejados por edad moscas hembra Cantón S mostró un efecto significativo de contenido de sacarosa en la dieta el tiempo de fatiga (log-rank, p <0,0001). Antes de experimento, las moscas fueron alimentados con una dieta de levadura / sacarosa / agar, con 10% peso / volumen síla concentración de ST, y un porcentaje variable de sacarosa dietética. Cinco viales de 20 moscas cada uno, fueron probados para cada dieta. Gráfico muestra cómo viales muchos todavía tienen cinco o más moscas se ejecutan en un momento dado. Estos resultados pueden ser tratados estadísticamente y gráficamente como la supervivencia (o tiempo hasta el fracaso) de la curva, con el "fracaso" de un vial que se define como un momento en que menos de cinco moscas siguen respondiendo a los estímulos geotaxis negativo. Tenga en cuenta que muchos otros diseños de estudio posibles y tratamientos estadísticos son posibles, y el tratamiento de datos y medición debe ser adaptado a los propósitos individuales.

Discussion

El protocolo general que aquí se presenta ha tenido éxito en la documentación de los efectos fisiológicos después del entrenamiento. Sin embargo, varias zonas de este protocolo están sujetos a modificaciones para adaptarse a las necesidades particulares de experimentación. Por ejemplo, la duración de la formación y el número de ataques podría ser variada para que el programa sea más o menos difícil, según se desee. La altura del recipiente en el que se mide la capacidad geotaxis negativo podría ser alterado para aumentar la superficie disponible para la mejora a ser documentado. Varios métodos de automatización de la cuantificación de la velocidad de ascenso también puede ser aplicable. En principio, cualquier programa de software capaz de distinguir una mosca de fondo puede ser utilizado para acelerar el proceso de recopilación de datos.

Algunos aspectos del protocolo sólo debe modificarse con mucha cautela, sin embargo. Por ejemplo, los experimentos preliminares indican fuertemente que al menos un día de descanso por semana tiende a facilitar una mayor improvimiento de ejercicio diario implacable. Además, los ritmos circadianos y la temperatura se sabe que afectan el movimiento de animales de sangre fría. La hora del día que el entrenamiento se lleva a cabo puede variar, pero siempre debe ser coherente dentro de determinados grupos en comparación, con el fin de evitar la posibilidad de efectos de confusión de los ritmos circadianos. El control de temperatura es también esencial, y se recomienda una sala dedicada a temperatura constante a los equipos de ejercicio casa. Por último, los machos y las hembras deben ser criados y miden por separado, con el fin de evitar la posibilidad de efectos de confusión de las diferencias de fertilidad y el sexo en la capacidad de ejercicio.

Las posibles aplicaciones de esta metodología sólo están limitadas por la imaginación del investigador. En un trabajo preliminar, hemos utilizado esta metodología en tres aplicaciones principales:

1. Para medir el efecto del ejercicio de resistencia sobre los diversos aspectos de la biología de tipo salvaje a través de las edades.
2. To medir el efecto del ejercicio de resistencia en determinados fenotipos mutantes.
3. Para detectar los factores genéticos que son necesarios para ejecutar los beneficios del ejercicio

Cada una de estas aplicaciones abarca una amplia variedad de posibilidades específicas. Basándonos en nuestra experiencia preliminar, fenotipos mutantes tienden a variar con el nivel de ejercicio tanto como varían con la dieta. El uso de modelos de invertebrados para comprender mejor la relación entre la dieta, el ejercicio y la fisiología del envejecimiento es quizás la aplicación general más importante de este protocolo.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Dayton Motorreductor	Grainger	1LRA6A
Raco Caja de distribución eléctrica	Grainger	5A052
Raco cubierta	Grainger	5A053
Cooper Bussmann Fusible	Grainger	6F043
Cooper Bussmann Portafusibles	Grainger	1DD33
Carling Technologies Interruptor	Grainger	2X464
Control de Dayton, AC / DC de velocidad	Grainger	4X796
Flugs con estrechos viales de plástico	Genesee Científico	49-102