Mycobacterium tuberculosis forma biofilms de drogas tolerantes cuando se cultivan en ciertas condiciones. Aquí se describen los métodos para el cultivo de M. biopelículas la tuberculosis y la determinación de la frecuencia de las drogas persisters tolerantes. Estos protocolos serán útiles para futuros estudios sobre los mecanismos de tolerancia a las drogas en M. la tuberculosis.
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Artículo de método
Crecimiento de Mycobacterium tuberculosis Las biopelículas
En este artículo
Resumen
Resumen
Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis humana, tiene una extraordinaria capacidad para sobrevivir a las tensiones ambientales, incluidos los antibióticos. A pesar de la tolerancia al estrés de M. la tuberculosis es uno de los probables contribuyentes a la quimioterapia de largo de 6 meses de la tuberculosis 1, los mecanismos moleculares que subyacen a este fenotipo característico del patógeno siguen sin estar claros. Muchas de las especies microbianas han evolucionado para sobrevivir en ambientes estresantes auto-montaje en el altamente organizado, de superficie unida, y las estructuras matriciales encapsulados denominadas biofilms 2-4. El crecimiento de las comunidades parece ser una estrategia de supervivencia preferente de los microbios, y se logra a través de los componentes genéticos que regulan la fijación de superficie, la comunicación intercelular, y la síntesis de sustancias poliméricas extracelulares (EPS) 5,6. La tolerancia al estrés ambiental es probablemente facilitado por EPS, y tal vez por el physiolola adaptación lógica de bacilos individuo a microambientes heterogéneos dentro de la compleja arquitectura de las biopelículas 7.
En una serie de trabajos recientes se estableció que el señor la tuberculosis y Mycobacterium smegmatis tienen una fuerte tendencia a crecer en estructuras multicelulares organizados, llamados biofilms, que pueden tolerar más de 50 veces la concentración mínima inhibitoria de los medicamentos antituberculosos isoniazida y la rifampicina 10.08. M. la tuberculosis, sin embargo, curiosamente requiere condiciones específicas para formar biofilms maduros, en particular, relación 9:1 de espacio de cabeza: los medios de comunicación, así como el escaso intercambio de aire con la atmósfera 9. Requisitos de las condiciones ambientales especializados, posiblemente, podría estar relacionado con el hecho de que M. la tuberculosis es un patógeno humano obliga y por lo tanto se ha adaptado a los ambientes del tejido. En esta publicación se demuestra métodos para el cultivo de M. tuberculosisbiopelículas en una botella y un formato de placa de 12 pocillos, que es conveniente para los estudios bacteriológicos, así como genéticos. Hemos descrito el protocolo para una cepa atenuada de M. la tuberculosis, el mc 2 7000, con la supresión de los dos loci, PANCD y la RD1, que son fundamentales para el crecimiento in vivo del patógeno 9. Esta cepa puede ser utilizado con seguridad en una contención BSL-2 para la comprensión de la biología básica del patógeno de la tuberculosis evitando así la exigencia de una costosa instalación de BSL-3. El método puede ser extendido, con las modificaciones apropiadas en los medios de comunicación, para crecer biofilm de otras especies de micobacterias cultivables.
En general, un protocolo uniforme de las biopelículas de cultivo de micobacterias ayudará a los investigadores interesados en estudiar las características básicas de las micobacterias resistentes. Además, un método claro y conciso de las biopelículas de crecimiento de micobacterias también ayudará a la inv clínica y farmacéuticaestigators para probar la eficacia de un fármaco potencial.
Protocolo
1. Biopelículas de crecimiento de M. la tuberculosis en una botella de 250 ml con tapa rosca
- Preparación de medios de comunicación: Disolver 0,5 g de KH 2 PO 4, 0,5 g de MgSO 4, 4 g de L-asparagina, 2 g de ácido cítrico, 0,05 g de citrato férrico amónico, 60 ml de glicerol en 900 ml de agua. Ajustar el pH a 7,0 con NaOH. Autoclave, enfriar y justo antes de iniciar el experimento, añadir estéril ZnSO 4 a una concentración final de 0,1% w / v Desde 7000 mc 2 es un auxótrofo pantotenato de esta cepa también requiere que el ácido pantoténico en 10μg/mL de la concentración final.
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Discusión
La tuberculosis (TB), causada por la infección de Mycobacterium tuberculosis, sigue siendo una gran amenaza para la salud pública mundial. Casi un tercio de la población mundial se estima que se forma asintomática infectada por el patógeno, cerca de 9 millones de nuevos casos aparecen en la clínica todos los años con síntomas de tuberculosis activa y alrededor de 1,7 millones de personas mueren de la infección todos los años 11. El enorme peso de la enfermedad es principalmente aportados por la falta.......
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Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
El trabajo se llevó a cabo con el apoyo financiero del Instituto Nacional de Salud y Asociación Americana del Pulmón.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Incubadora | VWR international | Modelo # 1923/25 | |
| Botellas de cultivo de poliestireno | Fisher Scientific | 03-374-300 | |
| Placa de cultivo celular de 12 pocillos | VWR international | 62406-165 | |
| Tubos cónicos de 50 mL | VWR international | 89039-660 | |
| Agitador orbital | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 57019-662 | |
| Refrigerador cromatográfico | VWR international | 55702-520 | |
| Placa de Petri | VWR international | 25384-342 | |
| KH2PO4 (monobásico) | EMD Millipore | PX1565-1 | |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | |
| L-asparagina | Sigma-Aldrich | A4284-100G | |
| Ácido cítrico | Sigma-Aldrich | C1857-100G | |
| Citrato férrico amónico | Sigma-Aldrich | F5879-100G | |
| Glicerol | EMD Millipore | GX0185-5 | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S8045-500G | |
| ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z4750-500G | |
| Ácido D-pantoténico | Sigma-Aldrich | P2250-25G | |
| Caldo Difco Middlebrook 7H9 | BD Biosciences | 271310 | |
| Enriquecimiento Middlebrook OADC | BBL | 212351 | |
| Tween-80 | Fisher Scientific | T164-500 | |
| Botella de almacenamiento de 250 mL | Corning | 430281 | |
| Placas de 12 pocillos | Falcon BD | 353043 | |
| Rifampicina | Sigma-Aldrich | R3501-1G | |
| Metanol | JT Baker | 9070-05 | |
| Jeringa de 10 mL | BD Biosciences | 301604 | |
| Puntas de pipeta de 1-200μL | VWR international | 89079-458 | |
| Parafilm M | VWR international | PM-996 | |
| Tubo cónico de 15 mL | Greiner Bio-One | 188-285 | |
| Agar Difco Mycobacteria 7H11 | BD Biosciences | 283810 | |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| Na2HPO4 (dibásico) | Sigma-Aldrich | S0876-500G |
Referencias
- Saltini, C. Chemotherapy and diagnosis of tuberculosis. Respir. Med. 100, 2085-2097 (2006).
- Hall-Stoodley, L., Stoodley, P. Biofilm formation and dispersal and the transmission of human pathogens. Trends Microbiol. 13, 7-10 (2005).
- Costerton, J. W., Stewart, P. ....
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