Artículo de método

Expresión y purificación de la proteína transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia en la Saccharomyces cerevisiae

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DOI:

10.3791/3860

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10 de marzo de 2012

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1Faculty of Life Sciences, University of Manchester

En este artículo

Resumen

Los intentos para expresar la transmembrana de la fibrosis quística regulador de la conductancia (CFTR) en Saccharomyces cerevisiae, Hasta ahora, dado cantidades relativamente bajas de proteína. Este protocolo y los reactivos asociados distribuidos a través de la Fundación de Fibrosis Quística debe permitir la preparación de cantidades de miligramos de esta "difícil" proteína de la membrana eucariota.

Resumen

La fibrosis quística transmembrana regulador de la conductancia (CFTR) es un canal de cloruro, que cuando está mutado, puede dar lugar a la fibrosis quística en humans.There es por lo tanto, un considerable interés en esta proteína, pero los esfuerzos para estudiar su estructura y actividad se han visto obstaculizados por la dificultad de expresión y purificación de cantidades suficientes de la proteína 1-3. Al igual que muchos de los difíciles de proteínas de membrana eucariotas, la expresión en un organismo de crecimiento rápido es deseable, pero difícil, y en la levadura S. cerevisiae, hasta ahora cantidades bajas se obtuvieron y una rápida degradación de la proteína recombinante se observó 4-9. Las proteínas involucradas en el procesamiento de CFTR en la levadura recombinante se han descrito 6.9. En este informe se describe una metodología para la expresión de CFTR en la levadura y su purificación en cantidades significativas. El protocolo describe cómo los problemas de la proteólisis anteriores se pueden superar y cómo los niveles de expresión deCFTR puede ser mejorado mediante la modificación de las condiciones de crecimiento de células y mediante el control de las condiciones de inducción, en particular, el período de tiempo antes de la recolección de células. Los reagants asociados con este protocolo (CFTR murino que expresan las células de levadura o plásmidos de levadura) se distribuyen a través de los EE.UU. Fundación de Fibrosis Quística, que ha patrocinado la investigación. Un artículo que describe el diseño y síntesis de la CFTR constructo empleado en el presente informe se publicará por separado (Urbatsch, I.;. Thibodeau, P. et al, inédito). En este artículo vamos a explicar nuestro método de inicio de la transformación de las células de levadura con la construcción de CFTR - la levadura que contiene el plásmido (Fig. 1). La construcción cuenta con una proteína verde fluorescente (GFP) fusionada a la secuencia CFTR en su extremo C-terminal y sigue el sistema desarrollado por Drew et al. (2008) 10. El GFP permite la expresión y purificación de CFTR que debe seguirse con relativa facilidad. El protoc Jove visualizaracabados ol después de la preparación de microsomas de las células de levadura, aunque incluyen algunas sugerencias para la purificación de la proteína a partir de los microsomas. Los lectores pueden añadir sus propias modificaciones en el procedimiento de purificación de microsomas, depende de los experimentos finales que se llevarán a cabo con la proteína y el equipo local a su disposición. La levadura expresa la proteína CFTR puede ser parcialmente purificada usando iones metálicos cromatografía de afinidad, usando una etiqueta polihistidina depuración intrínseca. Después de exclusión por tamaño cromatografía produce una proteína que parece ser> 90% de pureza, según se juzga por SDS-PAGE y tinción con Coomassie del gel.

Protocolo

1. Preparación de los medios y tampones

  1. YNB: Para un litro, suspender 6,9 g de levadura base de nitrógeno sin aminoácidos y 0,77 g de mezcla completa sin suplemento uracilo en 1 l de agua. Autoclave. Almacenar a 4 ° C.
  2. YNBA: Para 400 ml, suspender 2,76 g de levadura base de nitrógeno sin aminoácidos, 0,38 g de mezcla completa sin suplemento uracilo y agar 8g bacteriológica en 350 ml de agua. Autoclave. Mezclar 8 g de glucosa con 50 ml de agua y se calienta suavemente hasta que se disuelva. Esterilizar a través de un filtro de 0,2 micras y añadir a la YNBA mientras que el agar es fundido. Guarde a temperatura ambiente.
  3. 20% de glucosa del medio: Por 500 ml, mezclar 100 g de glucosa con 500 ml YNB y calentar suavemente hasta que se disuelva. Pasar a través de un filtro de 0,2 micras en un frasco estéril de Durán. Guarde a temperatura ambiente.
  4. 20% medio de la galactosa: Para 2 litros, mezclar 400 g de galactosa con YNB 2l y calentar suavemente hasta que se disuelva. Pasar a través de un filtro de 0,2 micras en un frasco estéril de Durán. Conservar a los estribos sala detura.
  5. Las poblaciones de inhibidores de la proteasa: CFTR es altamente susceptible a la proteolisis 4. Los autores encontraron los siguientes inhibidores de ser eficaz en la limitación de la proteólisis, aunque los lectores pueden desear adaptar esta lista para satisfacer sus propias necesidades. Almacenar en 100 ml de alícuotas a -20 ° C para reducir los problemas de congelación-descongelación. Todos los inhibidores se debe diluir de las soluciones madre a la concentración de trabajo de la siguiente manera:
Inhibidor Concentración de archivo Preparación de archivo Concentración de Trabajo
AEBSF 200 mM Disolver 48 mg en 1 ml de agua destilada 0,2 mM
Benzamidina 300 mM Disolver 36 mg en 1 ml de agua destilada 0,3 mM
Quimostatina 4 mM Disolver 2,5 mg en 1 ml seca DMSO 4 micras,
E-64 7 mM Disolver 2,5 mg en 1 ml de agua destilada 7 mM
Leupeptina 20 mM Disolver 10 mg en 1 ml de agua destilada 20 mM
Un Pepstatina 15 mM Disolver 10 mg en 1 ml de DMSO seco 15 mM
PMSF 1 M Disolver 174mg en 1 ml de DMSO seco 1 mM
  1. DTT (1 M): Se disuelven 154 mg de ditiotreitol en agua destilada 1ml. Almacenar a -20 ° C. Utilice en la dilución 1:1000 en los tampones se indica.
  2. EDTA (0,5 M): Mezcla de 29,22 g de ácido etilendiaminotetraacético con 100 ml de agua. Añadir 10 N de NaOH, gota a gota hasta que todo el EDTA se ha disuelto y el pH alcanza 8. Completar hasta 200 ml con agua y pasar a través de un filtro de 0,2 micras en un frasco estéril de Durán. Guarde a temperatura ambiente.
  3. CRB (300 mM Tris-HCl,pH 7,4, 0,56 M de sorbitol, 1 mM EDTA): Se disuelven 18,17 g de Tris-base en agua de 350 ml y ajustar el pH a 7,4 mediante la adición de HCl. Añadir 51,35 g de sorbitol y hacer volumen hasta 500 ml con agua. Autoclave. Añadir 1 ml de solución madre de EDTA y se almacena a 4 º C.
  4. CFTR tampón (50 mM Tris, pH 8,0, 10% v / v de glicerol): Disolver 6,06 g de Tris-base en 500 ml de agua. Ajustar el pH a 8 con HCl, se añaden 100 ml de glicerina y completar hasta 1 l con agua. Autoclave y se almacena a 4 º C.
  5. 2x colorante de carga: 50 mM Tris-HCl (pH 7,6), 5% de glicerol, EDTA 5 mM (pH 8,0), 0,02% azul de bromofenol, 4% de SDS, 0,05 M DTT. Haga de 10 ml, alícuota y almacenar a -20 ° C.

2. Los transformantes de detección

Este protocolo se supone que el gen de fusión CFTR-GFP-8His se ha insertado en un plásmido de levadura aguas abajo a un promotor GAL1 galactosa (Fig. 1) y que el plásmido se ha transformado en FGY217 células, una deleción PEP4 mutante de S. cerevisiae 10 . Las células pueden ser cultivadas en placas YNBA y almacenados durante varias semanas a 4 ° C. Para el almacenamiento a largo plazo, las acciones de glicerol debe hacer y se almacenó a -80 º C. Métodos para la clonación y la transformación se describen en detalle por Drew et al. (2008) 10.

  1. Elige bien separadas 5-10 colonias de una placa de transformación. Transferir cada colonia a una separada estéril tubo Falcon de 50 ml que contiene 9 ml de YNB y 1 ml de medio de glucosa al 20%. Para este paso, es importante tener una concentración final de 2% de glucosa (w / v) en el cultivo para mantener el crecimiento celular. Crecer durante la noche durante 16 horas a 250 rpm, 30 ° C en un incubador orbital agitación.
  2. Hacer existencias glicerol para cada una de las colonias seleccionadas. Añada asépticamente 0,8 ml de los cultivos de una noche de 0,2 ml de glicerol estéril en la etiqueta con tapón de rosca viales, agitar brevemente y almacenar a -80 ° C.
  3. Diluir los cultivos restantes durante la noche a un volumen final de 50 ml en YNB, incluyendo 250 l de medio de glucosa al 20%.Para este paso, es importante para diluir la concentración de glucosa a aproximadamente 0,1% (w / w) en el cultivo porque la glucosa alta puede reprimir el promotor GAL1 10. Los cultivos en la etiqueta Erlenmeyer de 250 ml desconcertado frascos a un OD 600 de 0.7-0.8 a 250 rpm, 30 ° C en un incubador orbital de agitación.
  4. Inducir los cultivos mediante la adición de 5 ml de medio galactosa 20% a cada matraz y crecer durante 16 horas.
  5. Confirmar la expresión de CFTR mediante microscopía de fluorescencia. Tome 100 l de la cultura y añadir 100 l de glicerol para limitar la movilidad de células en una solución. Analizar las células en un microscopio de Delta Vision RT restauración (o similar), utilizando un láser azul con un filtro FITC (longitud de onda de excitación de 490 nm de longitud de onda y la emisión de 528-538 nm). Expresión positiva de la proteína de fusión GFP-CFTR debe ser visible como un anillo de la fluorescencia en la membrana plasmática de las células de levadura. Las células no transformadas de levadura puede utilizarse como un control.
  6. Transferir elculturas en tubos Falcon de 50 ml. Recoger las células por centrifugación a 3500 xg, 4 ° C durante 10 minutos en una centrífuga de mesa de trabajo. Mientras que la centrífuga se está ejecutando, preparar 2 tubos de microcentrífuga ml con tapas de rosca que contienen aproximadamente 500 l lavados con ácido cuentas de vidrio y el lugar en el hielo. Descartar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 500-800 l helado CRB con inhibidores de la proteasa. Traslado de las suspensiones de los tubos de microcentrífuga que contiene las cuentas y mantener en hielo.
  7. Lisis de las células sacudiendo vigorosamente / vórtex cada tubo de microcentrífuga durante 10 periodos de 30 segundos, descansando sobre el hielo entre los períodos. Un beadbeater puede emplearse como una alternativa, por ejemplo, un mini-beadbeater BioSpec operado durante 3 min.
  8. Coloque los tubos en una microcentrífuga de mesa y se centrifuga a 3.500 xg, 4 º C durante 5 minutos. Transferir los sobrenadantes que contienen la población membrana crudo para limpiar los tubos de microcentrífuga y el lugar en hielo. Añadir 500 l de hielo fresca co-ld CRB con inhibidores de proteasa a cada tubo y repetir el proceso para acumular las membranas.
  9. Recoger las membranas crudo haciendo girar a la velocidad máxima, 4 ° C en una microcentrífuga de mesa durante 2 horas. Descartar el sobrenadante y resuspender cada pellet en 50 tampón CFTR helada l.
  10. En tubos de microfuga limpios, mezclar 15 l de cada suspensión con 15 l de colorante de carga 2x pipeteando arriba y hacia abajo. Incubar a temperatura ambiente durante unos 10 minutos. No deje que hierva las muestras, ya que esto hará que las proteínas de membrana CFTR y la otra para formar agregados insolubles en SDS-y también desnaturalizar la etiqueta de las buenas prácticas agrarias.
  11. Cargar las muestras junto con PageRuler Plus estándares preteñidos proteína (Fermentas) en un 4-20% de gel de Tris / glicina gradiente (NuSep) y funcionar a 150 V durante 40 minutos o hasta que el frente de tinte se encuentra en la parte inferior del gel.
  12. Identificar las células que expresan altos por fluorescencia en gel. Colocar en un sistema de imágenes de fluorescencia, como un escáner Typhoon. Busque en la u de gelcantar el láser azul en una longitud de onda de excitación de 488 nm y una longitud de onda de emisión de 526 nm. La fusión GFP-CFTR debe ser visible a aproximadamente 220 kDa. También habrá una banda débil fluorescente visible en alrededor de 70 kDa que es probablemente una levadura que contiene FAD intrínseca proteína de membrana (como succinato deshidrogenasa subunidad A) 11,12.
  13. Teñir el gel con Coomassie, destain y escanear el gel de comparación para el análisis de fluorescencia utilizando una imagen de visión conveniente paquete de software. El gel teñido con Coomassie permite una evaluación relativa de los niveles de expresión de CFTR-GFP en diferentes líneas clonales después de la normalización de la cantidad de proteína total cargado en cada pista del gel.
  14. Streak la línea celular que expresa más alto de su stock de glicerol (2.2) en un nuevo YNBA placa y se incuba a 30 ° C durante 2-3 días. Este plato se puede almacenar durante un máximo de 2 semanas a 4 ° C.

3. A gran escala Fermentador CultoUre

  1. Preparar las culturas pre-para el fermentador. Raspe un área de 1 cm 2 de las células de la YNBA placa (2,13) ​​utilizando un bucle estéril y añade a 45 ml de YNB y 5 ml de 20% medio de glucosa, de tal manera que el diámetro exterior 600 es aproximadamente 0,1. Crecer en 250 ml erlenmeyers desconcertado a 250 rpm, 30 ° C en un incubador orbital de agitación hasta que la OD 600 llega a 1.
  2. Dividir la cultura entre dos Erlenmeyer de 2 litros desconcertado frascos conteniendo cada uno 450 ml y 25 ml YNB 20% medio de glucosa. Crecer en estos a 250 rpm, 30 ° C en un incubador orbital de agitación hasta que la OD 600 llega a 1,2.
  3. Si bien estas culturas pre-están creciendo, estableció el fermentador. Hacer 11.2l de YNB como se describe en 1,1, pero se disuelven un adicional 8,28 g YNB y 0,95 g gota a cabo suplemento para compensar la adición de glicerol en la inducción. Agregar asépticamente el 11,2 l YNB y 75 ml de 20% medio de glucosa a un recipiente fermentador 20l estéril y ajustar la temperatura de funcionamiento a30 ° C.
  4. Agregar asépticamente los precultivos al fermentador y establecer la velocidad de agitación a aproximadamente 800 rpm y mantener la temperatura a 30 ° C. El aire comprimido debe fluir a aproximadamente 15 dm 3 min -1. Una vez que la cultura llega a un fermentador de 600 OD de 1,2, inducir añadiendo asépticamente 1,5 l YNB solución al 20% de galactosa y 1,2 l de glicerol. Reducir la temperatura a 25 ° C y crecer el cultivo durante 16 horas.
  5. Transferir el contenido del fermentador en ollas de centrífuga refrigerada 1 litro de hielo utilizando una bomba peristáltica. Recoger las células por centrifugación a 3.500 xg, 4 ° C durante 30 minutos en un rotor de gran capacidad (por ejemplo 6 litros). Resuspender las células en 150 ml de hielo frío CRB con inhibidores de proteasa. De aquí en adelante, todo el trabajo debe llevarse a cabo a 4 ° C.
  6. Lisar las células haciendo pasar a través de un disruptor de células Sistemas constante en 4 pases en 25, 30, 32 y 35 kPa, recogiendo el lisado en hielo en cada caso. Como alternativa, use un cordón de Beater (Biospec) con un volumen igual de ácido-lavados perlas de vidrio de 0,5 mm y agitar durante 3 minutos a plena potencia. Transferir el lisado a 50ml tubos Falcon y pellet los restos celulares por centrifugación a 3.500 xg, 4 ° C durante 15 minutos en una centrífuga de sobremesa.
  7. Transferir el sobrenadante a tubos de centrífuga refrigerada. Centrifugar a 14.000 xg, 4 ° C durante 30 minutos en una centrífuga para eliminar las mitocondrias.
  8. Transferir el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga refrigerada. Centrifugar a 200.000 xg, 4 ° C durante 90 minutos en una ultracentrífuga para recoger los microsomas.
  9. Decantar cuidadosamente y descartar el sobrenadante y añadir 2 ml de tampón helada CFTR con inhibidores de la proteasa y TDT 1 mM a cada tubo. Resuspender los pellets con un pincel, hasta la parte superior de cada tubo con tampón de CFTR y mezclar con un mezclador de vórtice.
  10. Centrifugar la suspensión a 200.000 xg, 4 º C durante 60 minutos en una ultracentrífuga, deseche las pastillas sobrenadante y resuspender en 2 ml de tampón helada CFTR winhibidores de la proteasa Ith (No TDT) con un pincel.
  11. Reunir las microsomas resuspendidos, ajustar el volumen final de 50 ml con el tampón de CFTR y mezclar bien. Reserva de una alícuota de 1 ml para el análisis en gel de SDS-PAGE, como se describe en 2,9 a 2,11. Los microsomas ahora puede ser flash congelados en nitrógeno líquido y después se almacenó a -80 ° C hasta que se necesite.
  12. CFTR se puede extraer de microsomas usando uno de los detergentes siguientes: litio perfluorooctonoate ácido (LiPFO), tetradecanoly-liso-fosfatidilglicerol (LPG14), N-dodecil-β-D-maltósido (DDM). Mezclar los microsomas con tampón de CFTR, inhibidores de la proteasa y 5% de detergente (w / w). Si se utiliza DDM, también se suman 300 mM de NaCl en el buffer. Agitar a 4 ° C durante 15 minutos en un mezclador de tubo.
  13. Centrifugar las muestras a 100.000 xg, 4 ° C durante 1 hora en una ultracentrífuga. Mantener el sobrenadante y tomar una pequeña alícuota para el análisis en gel de SDS-PAGE. CFTR ahora se puede purificar a partir del material solublised por metal inmovilizadocromatografía de afinidad seguido por cromatografía de exclusión por tamaño.

4. Los resultados representativos

La transformación de la levadura con el plásmido que contiene CFTR no es 100% eficiente. Un representante de pequeña escala de la pantalla de expresión CFTR en colonias seleccionadas de un experimento de transformación se producen alrededor de 1 en 4 colonias que expresan la proteína. Un resultado típico de una pantalla de 5 colonias seleccionar de una placa se muestra en el panel A de la figura. 3. Una de las colonias muestra un alto nivel de expresión de la proteína de fusión CFTR-GFP que normalmente se extiende entre los 250 kDa y 130 kDa marcadores, como se muestra. Los niveles de fluorescencia de GFP-CFTR puede variar considerablemente entre los experimentos, con la colonia en la figura 4. 3 que tengan al menos 10 veces mayor que la fluorescencia de la banda fluorescente intrínseca aproximadamente 70kDa. Si los niveles de expresión de CFTR-GFP parece dar menos de fluorescencia que la banda de 70 kDa, entonces es probable que vale la pena volver a la transformación y la elección de una coloniacon mayores niveles de CFTR-GFP expresión. Como se muestra en la fig. 3A, es poco probable, incluso con un alto nivel de expresión de CFTR-GFP, que la banda CFTR-GFP será discernible en el extracto celular por tinción de Coomassie.

Una vez que las colonias seleccionadas se han cultivado en experimentos a mayor escala, y los microsomas aislados, la presencia de CFTR-GFP dentro de los microsomas tendrá que ser evaluada, como se muestra en la fig. 3B. Los resultados de este experimento son importantes, no sólo para evaluar la eficiencia de la inducción de la expresión, sino también para comprobar que los microsomas se han preparado cuidadosamente y que la proteolisis ha sido minimizada. Los resultados se muestran en la figura. 3B implica que en este experimento la expresión de CFTR-GFP es algo inferior (según se juzga en relación con la banda de 70kDa intrínseca) que en el experimento a pequeña escala que se muestra en el panel A. Sin embargo, esta impresión es empujado por la sobreexposición del detector de fluorescencia en este medición. Esto se debió a que el experimentador era Checking para la presencia de fragmentos proteolíticos de la CFTR construir. Existe alguna evidencia en este experimento de algunos fragmentos fluorescentes proteolíticas entre los 130 kDa y 100 kDa marcadores, pero éstos son muy débiles en comparación con el de larga duración CFTR-GFP banda. Con los inhibidores de la proteasa se describe aquí, encontramos poca evidencia de la degradación proteolítica de CFTR después de la rotura de la célula. Si la proteólisis significativo se observa, se recomienda hacer nuevas soluciones madre del inhibidor de la proteasa. También hemos encontrado que la proteasa comerciales comprimidos cóctel de inhibidores no son tan eficaces para este sistema. El crecimiento de las células más allá de 16 h (después de la inducción) dará lugar a la expresión de CFTR disminuyó como se muestra en la Figura 4. Esto es probablemente debido a la rotación de la proteína, quizás debido a la regulación positiva de la maquinaria proteína de levadura de control de calidad 6-9,13. Por tanto, es aconsejable controlar los niveles de expresión de CFTR después de la inducción con galactosa, si es posible, ya que el momento óptimo para cosechar las células may varían de un laboratorio a otro.

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Figura 1. El CFTR construcción que contiene la levadura del plásmido. La fusión de CFTR-GFP-8His se inserta en el vector de expresión 2μ p424GAL1, bajo el control de una galactosa (GAL1) promotor. El vector también contiene un marcador de selección uracilo (URA) y un gen de resistencia a ampicilina (Amp).

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Figura 2. Un diagrama de flujo que resume el protocolo visualizado.

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Figura 3. Representativos geles SDS-PAGE de expresión de CFTR y purificación. El panel A muestra cinco elegidos al azar colonias transformantes (carriles 1-5) que fueron examinados para la expresión de CFTR. El panel B muestra microsomas que fueron aisladas de una FERM 15lintroducir la cultura. El panel C muestra purificada CFTR murino obtenido después de la purificación en dos etapas usando la cromatografía de afinidad seguido por cromatografía de exclusión por tamaño. Todos los geles se muestran bajo condiciones de iluminación de fluorescencia de interés desde el dominio de las buenas prácticas agrarias (izquierda) y después de Coomassie (derecha). Las posiciones relativas de los estándares de peso molecular se muestran a la izquierda (kDa).

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Figura 4. Los datos representativos para la expresión de CFTR en la levadura. El panel A muestra un curso temporal de la expresión de CFTR después de la inducción con galactosa. Los extractos celulares fueron analizados por SDS-PAGE, y la fluorescencia de GFP para la banda de la proteína CFTR-GFP se integró. Panel B muestra los resultados típicos de la microscopía de fluorescencia de GFP-que expresan las células 16 h después de la inducción. Normalmente, sólo una fracción de las células expresan CFTR en niveles altos.

Discusión

Este documento proporciona un método para la expresión de proteína CFTR murino en células de levadura, que debería facilitar la investigación sobre la fibrosis quística. El objetivo es vincular este trabajo con el lanzamiento de la construcción de ratón CFTR ADN, que estará disponible a través de la Fundación de Fibrosis Quística ( http://www.cff.org/research/CFFT/ ). Otros orthologs debería estar disponible más tarde. La transformación de las células de levadura con el vector que contiene CFTR es sencillo, pero es importante para la detección de colonias que expresan altos niveles de CFTR. Niveles variables de expresión pueden derivarse de varios factores, pero el número de copias del plásmido por célula probablemente representa un importante grado de variación. Los pasos críticos que se describen aquí debe permitir la producción de CFTR que expresan las células de levadura y que contienen membranas microsomales CFTR. Una vez que la transformación, crecimiento, cosecha y la lisis de las células de levadura han sido dominadas, Purificación de la proteína debe ser posible, y en la Figura 3 se ha dado un ejemplo de la pureza que debe ser alcanzable en este caso como una referencia útil. No es nuestra intención en este manuscrito para proporcionar una metodología detallada para la purificación de la proteína. Sin embargo, hay algunos pasos críticos intermedios de purificación que son específicos para el sistema de expresión S.cerevisae, tales como la lisis celular y purificación microsoma, y éstos se han incluido en detalle en este manuscrito. Cabe mencionar, sin embargo, que, aparte de los dos métodos que hemos utilizado, alternativas de levadura métodos ruptura celular pueden ser empleados, tales como el uso de una célula de presión Francesa. La proteína recombinante tiene una TEV-escindible dominio C-terminal GFP que permite que la proteína a ser rastreados después de la inducción (fig. 4). La levadura tiene una proteína intrínseca 70kDa (probablemente succinato deshidrogenasa 12) que presenta fluorescencia bajo las mismas condiciones 11, y esto puede proporcionar una herramienta útil entreestándar de calibración nal para los niveles de expresión relativos de CFTR en extractos de células enteras o microsomas (fig. 3). Es evidente a partir de los datos mostrados en la Figura 4 que el momento de la recolección de células después de la inducción con galactosa es crucial. Los rendimientos de caída de CFTR precipitadamente después de aproximadamente 16 horas de inducción, de modo que apenas hay CFTR detectable en células de levadura después de 24 horas de inducción.

El rendimiento de proteína purificada es de aproximadamente 1-2mg proteína CFTR por 15 litros cultura fermentador. La recuperación puede ser estimado como aproximadamente 70% del total de CFTR-proteína GFP hasta la fase de microsoma, y ​​alrededor del 25% de recuperación de la proteína purificada. Caracterización de la S. cerevisiae, expresó CFTR está en curso. Como se ve en la fig. 4, la localización de la proteína en la célula puede ser controlado por microscopía de fluorescencia. Aunque gran parte de la fluorescencia se encuentra alrededor de la periferia de la célula como se esperaba 10, parte de la proteína muestra una localización puntiforme, ya sea en ojusto dentro de la membrana plasmática, que podría ser debido a CFTR de reciclaje a través de una tarde de Golgi / endosomal vía 14 o tal vez un compartimiento posterior de la brotación de las vesículas de transporte de la sala de emergencia 4. El tratamiento con PNGasaF, una enzima que deglycosylates proteínas, mostró un cambio mínimo en la migración de la banda de proteína CFTR en SDS-PAGE, lo que implica que se no glicosilada, o tiene glicosilación mínima 15. Los experimentos en el estado de fosforilación de la proteína están en marcha. En algunos de los detergentes ensayadas hasta ahora, la proteína purificada muestra la actividad de ATPasa (que es inhibida por un inhibidor específico CFTR 16) a tasas que son similares a los publicados anteriormente 2,15. Medición de la actividad del canal CFTR requerirá la reconstitución de la proteína purificada, lo que implica una etapa de purificación final en un detergente que tiene una concentración crítica de micelas relativamente alta (CMC) 17. Levadura microsomas containing CFTR puede solublised con varios detergentes comúnmente empleados 18, incluyendo detergentes como dodecilsulfato maltósido 2, que son generalmente considerados como "suave". Sin embargo la mayoría de los detergentes cmc alta han demostrado ser ineficientes para solubilsation, hasta ahora, lo que sugiere que el intercambio en estos detergentes deben ser considerados en una etapa tardía en cualquier esquema de purificación.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Agradecemos a la Fundación de Fibrosis Quística (CFF) para la financiación de este trabajo a través de su Consorcio CFTR Estructura 3D (el número de concesión FORD08XX0). Reconocemos la enorme contribución de todos nuestros colegas en el Consorcio a este trabajo, en particular en el diseño de los genes CFTR. También reconocemos la valiosa contribución de los Dres. James Birtley (NCSR Demócrito, Grecia), Mark Young (Universidad de Cardiff, Reino Unido) y David Drew (Imperial College de Londres, Reino Unido) en las primeras etapas de la obra. Agradecemos especialmente a la Dra. Ina Urbatsch (Texas Tech. Universidad de Lubbock) para la lectura crítica del manuscrito.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo / equipo Empresa N ° de catálogo
FGY217 S.cerevisiae cepa, con pep4 supresión 10
La levadura base de nitrógeno sin aminoácidos Formedium CYN0410
Completa mezcla de suplemento sin uracilo Formedium DCS0169
Agar bacteriológico Sigma-Aldrich A5306
D-galactosa Pescador BP656-500
D-glucosa Pescador D16-500
Un Pepstatina Sigma-Aldrich P4265
Leupeptina Merck 108975
Quimostatina Sigma-Aldrich C7268
Phenylmethanesulfonylfluoride (PMSF) Sigma-Aldrich P7626
Epoxysuccinyl-leucylamido-butano (E-64) Sigma-Aldrich E3132
Aminoethylbenzenesulfonyl fluoruro (AEBSF) Sigma-Aldrich A8456
Benzamidina clorhidrato de Sigma-Aldrich 434760
Dimetilsulfóxido (DMSO) Sigma-Aldrich D8418
ditiotreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) Pescador BP120500
Tris-base Formedium TRIS01
Tris-HCl Pescador P631
D-sorbitol Sigma-Aldrich S1876
Glicerol Pescador 065017
NaCl Sigma-Aldrich S6191
n-dodecil-β-D maltopiranósido Affymetrix D310S
Azul de bromofenol Sigma-Aldrich 114391
PageRuler Plus estándares preteñidos proteínas Fermentas SM1811
NuSep tris-Gly 4-20% geles de gradiente NuSep NB10-420
Instantánea azul de Coomassie Novexin ISB1L
Cuentas de vidrio, lavados con ácido Sigma G8772
50 ml estériles Tubos Falcon Sarstedt 62.547.254
2 mlEstériles con tapa de rosca viales Sarstedt 72.694.005
250 ml estéril Erlenmeyers desconcertado BD Biosciences 355119
Erlenmeyer estéril 2l desconcertado frascos BD Biosciences 355131
Tubos de 2 ml de microfuga Sarstedt 72.695
0.2μM filtro de jeringa Sartorio FC121
tubos de ultracentrífuga Beckman Coulter 355618
tubos de centrífuga Beckman Coulter 357000
Potes de 1 litro de centrifugadoras Beckman Coulter 969329
Incubadora de agitación orbital con control de temperatura New Brunswick Scientific
Deltavision RT microscopio de la restauración Visión Aplicada
Centrífuga de mesa HERMLE Z300
Microcentrífuga de mesa Pescador 13-100-511
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Constante de los sistemas de disruptor celular Sistemas de constantes
Beadbeater disruptor celular BioSpec 1107900
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JA-17 rotor Beckman Coulter 369691
Optima L-100 Ultracentrífuga Beckman Coulter 392050
Rotor de 50.2Ti Beckman Coulter 337901

Referencias

  1. Ford, R. C., Birtley, J., Rosenberg, M. F., Zhang, L. CFTR three-dimensional structure. Methods Mol. Biol. 741, 329-346 (2011).
  2. Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. CFTR). J. Biol. Chem. 279, 39051-39051 (2004).
  3. Zhang, L., Aleksandrov, L. A., Riordan, J. R., Ford, R. C. Domain location within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein investigated by electron microscopy and gold labelling. Biochim. Biophys. Acta. 1808, 399-404 (2011).
  4. Kiser, G. L. Expression and degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in Saccharomyces cerevisiae. Arch. Biochem. Biophys. 390, 195-205 (2001).
  5. Huang, P., Stroffekova, K., Cuppoletti, J., Mahanty, S. K., Scarborough, G. A. Functional expression of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in yeast. Biochim. Biophys. Acta. 1281, 80-90 (1996).
  6. Ahner, A., Nakatsukasa, K., Zhang, H., Frizzell, R. A., Brodsky, J. L. Small heat-shock proteins select deltaF508-CFTR for endoplasmic reticulum-associated degradation. Mol. Biol. Cell. 18, 806-814 (2007).
  7. Fu, L., Sztul, E. ER-associated complexes (ERACs) containing aggregated cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) are degraded by autophagy. Eur. J. Cell. Biol. 88, 215-226 (2009).
  8. Sun, F. Derlin-1 promotes the efficient degradation of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) and CFTR folding mutants. J. Biol. Chem. 281, 36856-36863 (2006).
  9. Zhang, Y., Michaelis, S., Brodsky, J. L. CFTR expression and ER-associated degradation in yeast. Methods Mol. Med. 70, 257-2565 (2002).
  10. Drew, D. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat. Protoc. 3, 784-798 (2008).
  11. Knight, A. W., Billinton, N. Seeing the wood through the trees: A review of techniques for distinguishing green fluorescent protein from endogenous autofluorescence. Anal. Biochem. 291, 175-197 (2001).
  12. Robinson, K. M., Lemire, B. D. Isolation and nucleotide sequence of the Saccharomyces cerevisiae gene for the succinate dehydrogenase flavoprotein subunit. J. Biol. Chem. 267, 10101-10107 (1992).
  13. Gnann, A., Riordan, J. R., Wolf, D. H. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator degradation depends on. the lectins Htm1p/EDEM and the Cdc48 protein complex in. 15, 4125-4135 (2004).
  14. Yoo, J. S. Non-conventional trafficking of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator through the early secretory pathway. J. Biol. Chem. 277, 11401-11409 (2002).
  15. Zhang, L. Architecture of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein and structural changes associated with phosphorylation and nucleotide binding. Journal of Structural Biology. 167, 242-251 (2009).
  16. Wellhauser, L. A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability. Mol. Pharmacol. 75, 1430-148 (2009).
  17. Ramjeesingh, M. A monomer is the minimum functional unit required for channel and ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Biochemistry. 40, 10700-10706 (2001).
  18. Huang, P., Liu, Q., Scarborough, G. A. Lysophosphatidylglycerol: a novel effective detergent for solubilizing and purifying the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator. Anal. Biochem. 259, 89-97 (1998).

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