Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales Formadoras de Colonias derivados de la sangre del cordón umbilical

Resumen

Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son las células endoteliales circulantes con un robusto potencial de proliferación clonal que deben mostrarse intrínseca En vivo capacidad de formación. Caracterización fenotípica y funcional de las células endoteliales derivadas de la excrecencia CB son importantes para identificar y aislar Buena fe ECFCs de potencial aplicación clínica en la reparación de tejidos dañados.

Resumen

Puntos de vista de muchos años de la formación de nuevos vasos sanguíneos a través de la angiogénesis, vasculogénesis, y arteriogénesis se han revisado recientemente ^1. La presencia de células progenitoras endoteliales circulantes (EPC) se identificaron por primera vez en adultos sangre periférica humana por Asahara et al. En 1997 ^2, trayendo una infusión de nuevas hipótesis y estrategias para la regeneración vascular y reparación. EPC son componentes poco comunes, pero normal de la sangre circulante de que el hogar de los sitios de formación de vasos sanguíneos o el remodelado vascular, y facilitar tanto la vasculogénesis postnatal, la angiogénesis, o en gran medida a través de arteriogénesis estimulación paracrina de la pared de los vasos existentes derivan las células ^3. No hay un marcador específico para identificar un EPC ha sido identificado, y en la actualidad el estado del campo es comprender que numerosos tipos de células madre, incluyendo proangiogénico hematopoyéticas y las células progenitoras, las células circulantes angiogénicos, Tie2 ⁺ monocitos, cel progenitor mieloideLS, tumorales macrófagos asociados, y M2 macrófagos activados participar en la estimulación del proceso angiogénico en una variedad de sistemas de modelos animales preclínicos y en los sujetos humanos en numerosos estados de enfermedad ^{4, 5.} Las células endoteliales formadoras de colonias (ECFCs) son raras que circulan células viables endoteliales caracterizados por robusto potencial clonal proliferativa, colonia secundaria y terciaria capacidad de formación sobre replating, y capacidad para formar intrínseca en los vasos in vivo sobre el trasplante a ratones inmunodeficientes ^6-8. Mientras ECFCs se han aislado con éxito de la sangre periférica de adultos sanos, la sangre del cordón umbilical (CB) de recién nacidos sanos, y paredes de los vasos de numerosos vasos arteriales y venosos humanos ^6-9, CB cuenta con la mayor frecuencia de ECFCs ⁷ que la pantalla el más robusto potencial proliferativo clonal y forma los vasos sanguíneos duraderos y funcionales in vivo ^{8, 10-13.} Mientras que la derivación deECFC de la sangre periférica de adultos se han presentado ^{14, 15,} aquí se describen las metodologías para la derivación, la clonación, la expansión, e in vitro, así como en la caracterización in vivo de ECFCs del CB umbilical humana.

Protocolo

Reactivos y Soluciones

EMG-2 los medios de comunicación (Lonza, cat. N º CC-3162-2 que contiene la MBE medio basal y el EGM-2 Complementos kit SingleQuot, y los factores de crecimiento)

MBE-2 (Lonza, cat. N ° CC-3156) suplementado con los suplementos kit completo SingleQuot y factores de crecimiento (Lonza, cat. N ° CC-4176), 10% (v / v) de suero fetal bovino (FBS) y 1% (v / v) penicilina (10.000 U / ml) / estreptomicina (10.000 g / ml) / anfotericina (25 g / ml). Almacena hasta 1 mes a 4 ° C. Recomendados EGM-2 volúmenes a utilizar para la cultura ECFC son 500 l / pocillo de placas de 24 pocillos, 2 ml / pocillo p....

Discusión

Caracterización fenotípica y funcional de las supuestas células progenitoras endoteliales es importante identificar los ECFCs de buena fe que son capaces de clonación y la serie de re-siembra en la cultura y dar lugar a los vasos sanguíneos duraderos y funcionales implantables in vivo. La sangre de cordón umbilical humano se enriquece con ECFCs y la concentración de estos descensos que circulan células con el envejecimiento o la enfermedad ^10. Estudios recientes sugieren que ECFC pueden dese.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Heparina sódica inyectable, USP	APP Pharmaceuticals	504031
Ficoll-Pague	Amersham Biosciences	17-1440-03
Mezcla cánula	Maersk Medical	500.11.012
EGM-2	Lonza	CC-3162
SFB se define	Hyclone	SH30070.03
TrypLE expresa	Gibco	12605
Rata de colágeno tipo I	BD Biosciences	354236
Matrigel	BD Biosciences	356234
Bloquear FcR	Miltenyi Biotech	130-059-901
hCD31, FITC conjugaciónTed	BD Pharmingen	555445
hCD45, conjugado con FITC	BD Pharmingen	555482
hCD14, conjugado con FITC	BD Pharmingen	555397
hCD144, conjugado PE	eBioscience	12-1449-80
hCD146, conjugado PE	BD Pharmingen	550315
hCD105, conjugado PE	Invitrogen	MHCD10504
Sra. IgG1, k del anticuerpo, conjugado con FITC	BD Pharmingen	555748
D. IgG 1, anticuerpo k, conjugado PE	BD Pharmingen	559320
Sra. IgG2a, anticuerpo k, conjugado con FITC	BD Pharmingen	555573
Anti-CD31 humano	Dako	clon de JC70 / A
Anti-mousCD31 e	BD Pharmingen	553370
0,22-micras vacío sistema de filtración	Millipore	SCGPU05RE
Ácido acético glacial, 17.4N	Pescador	A38-500
Antibiótico-antimicótico	Invitrogen	15240-062
Suero fetal bovino (SFB)	Hyclone	SH30070.03
IHC zinc Fijador	BD Biosciences	550523
Sytox verde reactivo	Invitrogen	S33025
Cilindros de clonación y estériles	Fisher Scientific	07-907-10