Cruces sexuales y el aislamiento de la progenie recombinante son importantes herramientas de investigación para el hongo filamentoso, Fusarium graminearum Las técnicas necesarias realizar con éxito estos procesos se presentan.
Artículo de método
Desarrollo Sexual y descarga en las ascosporas Fusarium graminearum
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Resumen
Resumen
Fusarium graminearum se ha convertido en un sistema modelo para estudios en el desarrollo y la patogenicidad de los hongos filamentosos. F. graminearum más fácilmente produce cuerpos fructíferos, llamados peritecios, en agar zanahoria. Peritecios contienen numerosos tipos de tejidos, producidos en etapas específicas de desarrollo peritecios. Estos incluyen (en orden de aparición) la formación de las iniciales peritecio (que dan lugar a las hifas ascogenous), la pared exterior, Parafisos (micelio estéril que ocupan el centro de la peritecio hasta el ascos desarrollo), de los ascos y ascosporas dentro de los ascos 14. El desarrollo de cada uno de estos tejidos está separado por aproximadamente 24 horas y ha sido la base de los estudios transcriptomic durante el desarrollo sexual de 12,8. Consulte Hallen et al. (2007) para una descripción más detallada del desarrollo, incluidas las fotografías de cada etapa. Aquí se presentan los métodos para la generación y aprovechamiento síncronomente el desarrollo de jardines de peritecios para estudios temporales de regulación de los genes, el desarrollo y los procesos fisiológicos. Aunque estos métodos están escritos específicamente para ser utilizado con F. graminearum, las técnicas se pueden utilizar para una variedad de otros hongos, siempre que la fructificación se puede inducir en el cultivo y hay una cierta sincronía con el desarrollo. Recientemente hemos adaptado este protocolo para estudiar el desarrollo sexual de F. verticillioides. A pesar de peritecios individuo debe ser recogidas a mano en esta especie, ya que un césped de desarrollar peritecios no podía ser inducido, el proceso funcionó bien para estudiar el desarrollo (Sikhakolli y Trail, sin publicar).
La función más importante de los cuerpos fructíferos de hongos es la dispersión de las esporas. En muchas de las especies de Ascomycota (asca hongos productores), las esporas se tiran desde el asca, debido a la generación de presión de turgencia dentro del asca, la conducción de eyección de esporas (y fluido epiplasmic) a través delporo en la punta asca 2,7. Nuestros estudios de la descarga de ascosporas por la fuerza han dado como resultado el desarrollo de un "ensayo de descarga de esporas", que utilizamos para la detección de mutaciones en el proceso. Aquí se presentan los detalles de este ensayo.
F. graminearum es homotálica, y por lo tanto pueden formar cuerpos fructíferos en ausencia de una pareja compatible. La ventaja de homothallism es que el cruce no es necesario para generar descendencia homocigota para un rasgo particular, una faceta que ha facilitado el estudio del desarrollo sexual en esta especie 14,7. Sin embargo, las cepas heterotálica se han generado que se puede utilizar para el cruce de 5,9. También es posible cruzar cepas homotálicos para obtener mutantes de varios genes en una cepa 1. Esto se hace por coinoculating una placa de Petri con 2 cepas. A lo largo del punto de encuentro, la mayoría de peritecios será recombinante (siempre una mutación en una de las cepas progenitoras no inhibepolinización cruzada). A medida que los peritecios, que exudan las ascosporas en masa en lugar de forzar a la descarga. El exudado de esporas resultante (denominado un cirrhus) se sienta en la punta de la peritecio y se puede quitar fácilmente para la recuperación de esporas individuales. Aquí se presenta un protocolo para facilitar la identificación de los peritecios recombinante y la recuperación de la progenie recombinante.
Protocolo
1. La producción de peritecios
- Inocular el Centro de zanahoria agar 10 en un 6,0 diámetro cm plato de Petri con una cepa fértil de F. graminearum (se recomienda PH-1).
- Colocar inocularon platos bajo luces fluorescentes brillantes a temperatura ambiente (18-24 ° C) y permitir a crecer hasta micelio ha alcanzado el borde exterior de la placa de Petri (3-5 días). Las luces fluorescentes comerciales domésticos funcionar bien para estimular la formación de cuerpo fructífero y descarga.
- Suavemente eliminar los micelios aéreos con un palillo estéril.
- Distribuir 1,0 ml de 2,5% de Tween 60 acuoso a la superficie con un palo de hockey de vidrio estéril o extremo redondeado de una varilla de vidrio estéril.
- Volver placas a la luz. No agregue Parafilm a las placas.
- Después de 24 horas, la superficie de las placas deben tener un aspecto brillante. Si vuelve a aparecer el micelio, la superficie de raspado y volver a aplicar la solución de Tween-60.
- Observar el desarrollo de peritecios durante la próxima semana. Las etapas intermedias dedesarrollo peritecio pueden ser cosechadas raspando suavemente la superficie del agar y flash congelado para extracción de RNA (Figura 1).
- Esporas maduras se acumulan en la tapa de la placa por día 7. Inicialmente éstos sólo serán visibles bajo un microscopio de disección, pero por día 9, se han acumulado a la densidad suficiente como para ser visible a simple vista.
2. Ascosporas ensayo de descarga
- El día 6 después de la aplicación de la solución de Tween, cortar un círculo de 1 cm de diámetro del agar con un perforador de madera. Alternativamente, un bisturí puede ser utilizado para cortar un segmento de tamaño similar. El círculo puede ser cortado por la mitad y cada mitad coloca en un portaobjetos de vidrio.
- Orient las piezas manera que la superficie que contiene los cuerpos fructíferos es perpendicular a la superficie de la corredera, y las esporas se disparan a lo largo de la corredera.
- Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad durante la noche bajo las luces. Las esporas se acumulará sobrela corredera y ser visibles para el ojo desnudo a la mañana siguiente (Figura 2).
- Esporas acumuladas se pueden lavar fuera de la diapositiva con agua y se cuantificó si se desea.
- Potenciales inhibidores de descarga de ascosporas se puede ensayar por adición a la parte trasera del bloque de agar durante el montaje del ensayo. Algunos inhibidores de los canales iónicos que reducen la descarga han sido previamente ensayados con esta técnica 15.
3. Generación de progenie recombinante
- Inicia cruzada mediante la inoculación de agar zanahoria con dos cepas de F. graminearum (una Nit + y una nits), colocando los puntos de inoculación en los lados opuestos de la placa de Petri.
- Una vez que las hifas han llenado la superficie, raspar parte aérea y aplicar de Tween-60 solución como se describe anteriormente. Use un marcador para observar en el lado de la placa de Petri donde las hifas se encuentran.
- Volver culturas a la luz y se incuba hasta peritecios se han desarrollado, y que han cirrhiarma para formar a los peritecios lo largo de la intersección entre las dos culturas.
- Bajo el microscopio de disección, traer a la vista los peritecios lo largo de la intersección de las dos culturas. Utilizando un pasador de insectos, se esteriliza y se sumerge en agua estéril, toque una cirrhus a lo largo de este borde ligeramente con la punta de la clavija. La humedad en el pasador debe permitir que las cirrhus a pegarse a la clavija.
- Enjuague la punta de la espiga con los cirrhus en que de cada 200 l de agua estéril en un tubo Eppendorf de separar las esporas.
- Llama la clavija, se humedece de nuevo y elegir otro cirrhus. Elige 10 a 15 cirrhi, y colocar cada uno en un tubo separado de agua.
- Tubos, agitar brevemente que contiene suspendidas cirrhi.
- Retirar 60 l de la suspensión de esporas con una pipeta y el lugar en un medio MMTS 1 en un 9 cm de placa de Petri. Extender con un palo de hockey estéril. La suspensión de esporas restante puede ser almacenado a 4 ° C durante hasta una semana y replated si es necesario.
- IncubaTE a temperatura ambiente (la luz no es necesario) durante 3-5 días hasta que las colonias muy pequeñas aparecen (Figura 3). Habrá dos tipos de fenotipos entre las colonias. Las colonias de nit tendrá hifas más escasas que las colonias + Nit. Cirrhi recombinante de peritecios se muestran ambos fenotipos de colonias en proporción aproximadamente igual. Desechar las placas con colonias de sólo un fenotipo en ellos. Tenga en cuenta que a veces, más de dos fenotipos resultar debido a la segregación de otros factores.
- Mueva las colonias de agar V8 o de zanahoria para el almacenamiento. Colonias de prueba en agar Czapek Dox (las cepas de nit-no crece en Czapek Dox) y el PDA con el clorato (0,5 clorato de potasio M; las cepas Nit + no va a crecer en la PDA con clorato) para confirmar el fenotipo correcta. Examine estas colonias de las cualidades deseadas.
4. Los resultados representativos
La producción de peritecios
El objetivo es tener un césped deperitecios sin micelios o esporas aparentes. La superficie de la cultura tendrá un aspecto similar al terciopelo negro (Figura 1). A las 24 h después de la aplicación de Tween la superficie del agar debe tener un ligero brillo. Si vuelve a aparecer el micelio, a continuación, la placa no puede haber sido raspada suficiente para inducir el desarrollo peritecios.
Ascosporas de descarga
Siempre dio en su ensayo de varios bloques de agar de la cepa de tipo salvaje. Si no lo hacen los bomberos, entonces o bien los peritecios son demasiado jóvenes o demasiado viejos. Si son demasiado viejos, y luego las hifas numerosos aparecerá sobre la superficie de la cultura le da un tono blanquecino. Si este no es el caso, pueden ser demasiado joven, y el ensayo debe ser juzgado de nuevo en 24 horas. Ocasionalmente, los cultivos no se descargan bien, y el experimento tendrá que ser repetido. Asegúrese de realizar el ensayo en las condiciones de luz adecuadas.
Progenie recombinante
recombinante deben constituir la mayoría de los peritecios lo largo de la intersección entre las dos cepas. Por lo general, procesar 10 cirrhi de una cruz y por lo menos 4.6 de los que debe ser recombinante. Muy de vez en cuando, una mutación impide que una cepa de apareamiento. Si uno de los padres tiene un fenotipo de crecimiento aberrante, entonces, más de 2 fenotipos pueden estar presentes entre las colonias en MMTS.
Figura 1. Etapas del desarrollo de peritecios en agar zanahoria. H Izquierda, de 72 años después de la aplicación de Tween. Nota pigmento rojo y peritecios muy jóvenes visible como algunos granos negros en la superficie. Derecho, a 144 h, peritecios maduros se han formado. Tenga en cuenta casi completa ausencia de micelio superficial en ambas culturas.
Figura 2. Descarga ensayo. El tapón de color naranja zanahoria agar está orientado de manera Thaesporas t fuerza descargados del peritecios maduro en su superficie se puede acumular en la superficie de la lámina de vidrio. 15 horas tiempo de acumulación.
Figura 3. Las diferencias de crecimiento entre Nit + y nit de colonias en medio MMTS selectiva. Las colonias de nit (puntas de flecha) son más pequeños. Las colonias Nit + (flechas) muestran un crecimiento robusto. Fotografía tomada después de 7 días.
Discusión
F. graminearum está particularmente bien adaptado para el estudio del desarrollo de la fructificación cuerpo debido a la disponibilidad de un genoma bien anotado ( mips.helmholtz-muenchen.de/genre/proj/FGDB / ; 4), y la disponibilidad de un Affymetrix- base de microarrays 6. Esto ha facilitado la capacidad de identificar genes importantes para la descarga de ascosporas 7,11,3. Los métodos que aquí se presentan permitirá a los investigadores a centrarse en un conjunto discreto de las etapas de desarrollo y las funciones para el análisis genético de los cuerpos fructíferos de F. graminearum. Los métodos también son fácilmente adaptables a los hongos relacionados que pueden ser inducidos a las frutas en cultivo, y puede ser utilizado como un estándar para el desarrollo en una variedad de otros tipos de hongos fructificación cuerpo.
La capacidad de evaluar un fenotipo de cocción de esporas pueden ser sutiles en las especies donde las esporas son pequeños y difíciles de ver, tales como F. graminearum. La colección de esporas en un portaobjetos limpio facilita tanto la evaluación visual, y la evaluación cuantitativa, ya que las esporas pueden ser lavados fuera de la diapositiva y su cuantificación. Algunas especies de hongos producen un mucílago que rodea a la espora y las esporas no se pueden enjuagar, pero deben ser contados al microscopio y cuando se mantengan en la diapositiva. Hemos encontrado que esto es cierto de Sclerotinia sclerotiorum.
Divulgaciones
No tenemos nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de la National Science Foundation (MCB-0923794 a FT).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Fusarium graminearum cepa PH-1 | Hongos Genética Stock Center, Kansas | FGSC 9075 | |
| Tween 60 | Sigma-Aldrich | P1629 | |
| Agar Czapek Dox del | Difco, Becton Dickinson | 233810 | |
| Clorato de potasio | Sigma-Aldrich | 255572 |
Referencias
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