Artículo de método

Bioensayo electroantenográfico como herramienta de detección de compuestos volátiles de las plantas hospederas

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DOI:

10.3791/3931

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6 de mayo de 2012

 ,  , 
1Plant Mycotoxin Research, U.S. Department of Agriculture, Agricultural Research Service

En este artículo

Resumen

Un método para rápidamente volátiles de las plantas huésped de pantalla mediante la medición de la respuesta electrofisiológica de la naranja ombligo adulto ( Amyelois transitella) A los componentes de antenas individuales y mezclas a través de análisis de electroantenográfico se demuestra.

Resumen

Volátiles de las plantas juegan un papel importante en las interacciones planta-insecto. Insectos herbívoros utilizan compuestos volátiles de las plantas, conocidas como kairomonas, para localizar su planta hospedera. 1,2 Cuando una planta huésped es un importante daño agronómica de los productos básicos de alimentación por plagas de insectos pueden causar graves pérdidas económicas a los productores. En consecuencia, kairomonas se puede utilizar como atrayentes para atraer o confundir a estos insectos y, por tanto, ofrecer una alternativa ecológica a los plaguicidas para el control de insectos. 3 Desafortunadamente, las plantas pueden emitir un número de sustancias volátiles, con grandes composiciones y proporciones variables de las emisiones que dependen de la fenología de la mercancía o la hora del día. Esto hace que la identificación de componentes biológicamente activos o mezclas de compuestos volátiles de un arduo proceso. Para ayudar a identificar los componentes bioactivos de las emisiones de las plantas hospederas volátiles que emplean el electroantenografía pruebas de laboratorio basado en bioensayos (GAE). GEA es una herramienta eficaz para evaluar y record electrofisiológicamente las respuestas olfativas de un insecto a través de sus receptores antenales. El proceso de selección EAG puede ayudar a reducir el número de sustancias volátiles a prueba para identificar prometedores componentes bioactivos. Sin embargo, los bioensayos EAG sólo proporcionan información sobre la activación de los receptores. No proporciona información sobre el tipo de comportamiento de los insectos el compuesto provoca, lo que podría ser como un tipo de atrayente, repelente o de otra índole de la respuesta conductual. Los compuestos volátiles que provoquen una respuesta significativa de EAG, con respecto a un control positivo adecuado, se suelen tomar en la realización de pruebas de respuestas de comportamiento de la plaga de insectos. El diseño experimental presenta en detalle la metodología empleada a la pantalla a base de almendras volátiles de las plantas hospederas 4,5 mediante la medición de las respuestas electrofisiológicas de las antenas de un adulto el ombligo de insectos plaga la naranja (Amyelois transitella) a los componentes individuales y combinaciones simples de componentes a través de EAG bioensayo. El método utiliza dos exantenas cised colocado a través de un porta-electrodos "tenedor". El protocolo se ha demostrado aquí se presenta una rápida y de alto rendimiento método estandarizado para la detección de compuestos volátiles. Cada volátil es un conjunto, cantidad constante de estandarizar el nivel de estímulo y permitir así que las respuestas de las antenas es indicativo de la chemoreceptivity relativa. El control negativo ayuda a eliminar la respuesta electrofisiológica tanto a la fuerza disolvente residual y mecánica de la calada. El control positivo (en este ejemplo acetofenona) es un compuesto único que ha suscitado una respuesta coherente desde el ombligo masculino y femenino la naranja (NOW), la polilla. Un estándar semioquímico adicional que proporciona una respuesta coherente y se utiliza para los estudios de bioensayo con el macho AHORA polilla es (Z, Z) -11,13-hexdecadienal, un componente de aldehído de la feromona sexual hembra-producido. 6-8

Protocolo

1. La preparación de compuestos volátiles detectados a partir de la planta huésped de EAG detección

  1. Después de la identificación y autentificación de todas las sustancias volátiles a través de GC-MS, el análisis EAG bocanada de cada uno disponible volátil. La selección inicial puede ser un número duplicado bajo de respuestas antenales (N = 3-5) para cada sexo con el fin de lograr una indicación de chemoreceptivity relativa en un corto período de tiempo (Tabla 1).
  2. Preparar una solución de cada volátil a un 5 mg / ml de concentración en pentano. Selle herméticamente y refrigerar la muestra hasta que esté listo para su uso inmediato (por ejemplo, acetofenona, densidad = 1,03 g / ml, volumen = (0,005 g/1.03 g / ml) x 1000 = 4,85 l de acetofenona en un matraz aforado de 1,0 ml y se diluye hasta 1,0 ml con pentano).
  3. Justo antes de su análisis EAG, eliminar los viales que contienen el 5 mg / ml de concentración de los volátiles a ensayar y se deja calentar a temperatura ambiente. Mientras tanto, marcar el número apropiado de pipetas Pasteur decorrelacionan con cada volátil a ensayar, y envolver un pequeño trozo de parafina (ca. 15 x 15 mm) sobre la punta de la pipeta. Para las pipetas de detección iniciales de estímulo 10 (N = 4 para cada hombre y mujer) se cargan en el caso de una preparación mal o un obstáculo imprevisto otro.
  4. Utilizando un par de pinzas, suavemente doblar el disco bioensayo en un medio para facilitar la colocación en la pipeta, a continuación, parcialmente colocar el disco doblado en el extremo grande de la pipeta para que ca. 2-3 mm del disco están expuestos. Alinear las pipetas marcadas y preparado en un soporte de estante.
  5. Utilizando una pipeta o una jeringa, cargar 10 l (50 mg) de solución volátil en cada disco y permitir 2 minutos antes de pasar completamente la inserción de los discos en la pipeta. Una vez cargado, inmediatamente sellar el extremo de la pipeta con parafilm (ca. 15 x 30 mm). La cantidad de estímulos volátiles para ser cargados y sopló más probable es que varía con las especies de insectos.
  6. Siguiendo el mismo protocolo que se ha indicado anteriormente, preparar los controles deincluir en cada análisis. Para la carga negativa de control de 10 l de pentano solo en cada disco, espere 2 minutos, cargar en la pipeta de la etiqueta y el sello. Para el control positivo, carga de 10 l (50 mg) en el disco, espere 2 minutos, la carga en la pipeta etiquetado y sellado con parafilm.
  7. La viabilidad de la preparación de las antenas de insectos más probable es que varían según las especies, pero hemos encontrado que Amyelois transitella antenas suelen permanecer activa y constante por más de 30 minutos después de la escisión con el protocolo descrito. Esta cantidad de tiempo que generalmente se permiten hasta 4-10 muestras volátiles para ser evaluados. Tabla 2 proporciona un ejemplo de los tiempos y las secuencias.

2. Preparación de las antenas de los insectos para el bioensayo EAG

  1. El objetivo de este experimento es el análisis de EAG, por lo que la suposición de que cada investigador tendrá acceso a los insectos criados adecuadamente.
  2. Para este experimento vamos a estudiar 3-4 días old, se aparearon las polillas masculinas y femeninas. Polillas individuales se transfieren a un pequeño recipiente con tapa de plástico del día de análisis. Inmediatamente antes de la bioensayo, la polilla a ensayar se transfiere de cabeza en un aparato de sujeción (es decir, a partir de diversas puntas pipeteador de plástico) y asegurado por detrás. La manipulación de los insectos puede ser visto bajo un bajo consumo de energía estéreo-microscopio para facilitar la escisión.
  3. Las antenas son objeto de burlas a cabo utilizando una herramienta de alambre en la punta. El titular de tenedor, con una pequeña película de gel de electrodo, se coloca en estrecha proximidad para la transferencia rápida de las antenas. La primera antena se extirpa el uso de tijeras micro y se coloca en el tenedor, asegurando la base de la antena se coloca en la porción no-rojo del tenedor (el electrodo de tierra indiferente). Un conjunto temporizador durante 10 minutos y se inicia la segunda antena se extirpa y se coloca al lado de la primera antena con ambas bases en el mismo lado del tenedor.
  4. Alternativamente, las antenas pueden quedar asegurada dentro de la holdintubo g, extirpados, entonces suavemente retirado de entre el tubo y el insecto utilizando una herramienta con punta de alambre con una pequeña cantidad de gel en el extremo.
  5. Antenas se comprueban para asegurar la base y la punta se sumergen en gel de electrodo y no hay burbujas están presentes en el gel. Los extremos y consejos pueden ser ajustados para garantizar la exposición total al gel para electrodos. Se debe tener cuidado para asegurar que el resto de cada antena no está cubierto con gel, garantizando así la máxima área de superficie antenal está expuesto a la calada.
  6. El tenedor preparado se inserta en la sonda de pre-amplificador y se mantiene bajo un constante flujo de aire húmedo a 200 ml / min durante el tiempo restante del período de espera de 10 minutos. El tiempo especial y EAG veces iniciación se observó (Tabla 2) y 30 segundos antes de la primera bocanada de estímulo, la pipeta que contiene el control positivo está abierta y se coloca en el soporte que se ajusta para dirigir el aire / bocanada flujo 2-3 mm desde el preparado antenas.
  7. Después de cada experperimento, las polillas de prueba son sacrificados en un ambiente de hielo seco y bien dispuestos.
  8. Las polillas hembras se diseccionan para comprobar el estado de apareamiento. Los hombres que cohabitan se supone que se han apareado.

3. EAG Protocolo de componentes individuales

  1. Respuestas antenales se registran a través del software incluido con AutoSpike el instrumento EAG Syntech. La configuración en la pestaña Propiedades AutoSpike para el canal con la sonda de EAG se ha fijado en una tasa de muestreo de 106,7, NO a la rectificación, y un filtro de 0 a 42 Hz. Por la ficha Filtro, el filtro de EAG está en ON y el punto de corte bajo se ajusta a 0,1 Hz.
  2. Bocanadas de estímulo son de 1-2 segundos de duración. Un contador de tiempo establecido para un minuto se inicia después de cada bocanada.
  3. La pipeta prueba volátil próximo está abierta y se coloca en el soporte. La secuencia de los volátiles de ensayo, aleatorizado entre ejecuta para asegurar que no compuestos de ensayo consistente seguir otra prueba volátil, es seguido a continuación (por ejemplo, Tabla 2) cuidadosamente allowing 1 minuto entre cada disparo.
  4. Para facilitar la lectura de las respuestas EAG, las porciones de los gobernantes se colocan sobre la pantalla del ordenador y el nivel basal hasta el ápice de la señal de deflexión hacia abajo se mide en milímetros y se registra en una hoja de datos (es decir, para el ajuste mV 5, 33 mm = 2,5 mV). El software tiene la capacidad de reproducción de las grabaciones guardadas para su posterior análisis. La conversión de mm a cualquiera mV o amplitud mV se realiza en el análisis de datos más adelante.
  5. Después de la bocanada final de control positivo (por ejemplo, el registro # 12) se administra, las antenas se retiran, el tenedor se limpia con una toallita de etanol saturado y se deja secar antes de su uso posterior.
  6. Para aumentar el rendimiento de los ensayos, la escisión de la siguiente serie de antenas puede ser iniciado por un personal de laboratorio de segunda a unos 10 minutos antes del final del experimento actual - después de la cuarta de hojaldre, la segunda prueba volátil de la experiencia actual, según la tabla 2. Esto permitirá FOr el comienzo del experimento siguiente directamente después de los extremos experimento actual.
  7. Mayor número de repeticiones (a antenas diferentes) puede realizarse en compuestos de interés para proporcionar una mayor validación estadística.

4. Un ejemplo de análisis de los EAG mezclas u otras matrices (Tabla 3)

  1. A continuación, las proporciones y los volúmenes de dos mezclas terciarias (3-componente mezclas) se calcula para proporcionar un ejemplo de la combinación de compuestos volátiles que suscitan respuestas de alta EAG (Tabla 4). Los cálculos son para algunas relaciones básicas, una proporción 1:1:1 molar de α-humuleno: 2-undecanona: 2-feniletanol y luego comparar a una relación de mezcla de la segunda 1:02:04.
  2. Utilizando protocolos similares se describió anteriormente, las mezclas se preparan y etiquetados pipetas Pasteur se cargan junto con los controles necesarios positivos y negativos.
  3. Las muestras volátiles se inflan a través de antenas de los machos y hembras, y las respuestas se miden y haber iniciado sesióna una hoja de datos (Tabla 3).

5. Los resultados representativos

Para la naranja ombligo femenino las siguientes opciones se utilizan: 2 inhalaciones segundo, 10 veces segundo disco, 10 segundos de la ventana, y el 5 de escala de mV. Una desviación negativa es la respuesta típica, sin embargo, el valor absoluto se registra (por ejemplo, -3.400 deflexión mV se registra como 3.400 mV). Una respuesta relativamente débil de la preparación para el control positivo se descarta. Figura 1 proporciona una representación gráfica de una mala respuesta al control positivo por la naranja ombligo.

Por ejemplo de un resultado pobre control, la media de respuesta de las hembras antenal a acetofenona es típicamente ca. 2.600 mV (Figura 2), si la preparación sólo dio una respuesta de ca. 1.300 mV que se descarta y se prepara otro par de antenas. Del mismo modo, la respuesta media de los hombres de (Z, Z) -11,13-hexadecadienal era tipicay 3.000 mV, por lo que cualquier respuesta es inferior a 1.500 mV se descartó típicamente.

El control positivo al comienzo y al final de cada experimento también proporciona información relativa a la condición de las antenas. Una regla de oro se sigue para la detección rápida es si la respuesta antenal a la nube de la post-control (expediente n º 12, Tabla 2) es menor que el 75% del hojaldre 1 º de la pre-control (registro # 1 , Tabla 2) o menor que el hojaldre 2 ª de la pre-control (registro # 2, Tabla 2) a continuación, el experimento no se utiliza en el análisis de datos debido a la posible degradación de la preparación (Figura 3). Un ejemplo de la primera regla de oro sería el registro # 1 = 2.730 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, y la segunda regla de oro si el registro n º 2 = 2.350 mV y el registro n º 12 = 1680 mV, en cada uno de estos casos , los resultados del PREP y el experimento se descarta.

Aejemplo representativo de la corrección de los valores de respuesta EAG medidos para el control positivo sería como sigue.

Ejecutar # GAE (mV) Ejecutar # 2 GAE (mV) Ejecutar # 3 GAE (mV)
(+) Ctrl 2800 (+) Ctrl 2420 (+) Ctrl 3030
Un Cmpnd 3000 Un Cmpnd 2500 Un Cmpnd 3440
(-) Ctrl 530 (-) Ctrl 755 (-) Ctrl 910
Cmpnd B 2400 Cmpnd B 2000 Cmpnd B 2560
(+) Ctrl 2770 (+) Ctrl 2400 (+) Ctrl 3020

Utilizando los valores anteriores para un N = 3 experimento, la respuesta de control negativo se resta de cada valor dentro de cada experimento bajo el supuesto de que el control negativo es la respuesta basal antenal a la bocanada mecánica y el disolvente residual.

Run # 1 GAE (mV) Ejecutar # 2 GAE (mV) Ejecutar # 3 GAE (mV)
(+) Ctrl 2270 (+) Ctrl 1665 (+) Ctrl 2120
Un Cmpnd 2470 Un Cmpnd 1745 Un Cmpnd 2530
(-) Ctrl 0 (-) Ctrl 0 (-) Ctrl 0
Cmpnd B 1870 Cmpnd B 1245 Cmpnd B 1650
(+) Ctrl 2240 (+) Ctrl 1645 (+) Ctrl 2110

Los controles positivos para cada experimento a continuación se promediarán y corregido en 1000 mV, teniendo en cuenta la relación para la corrección de 1000 mV. Una hoja de datos (por ejemplo, Excel) puede ser fácilmente manipulado para convertir las respuestas a los datos utilizables.

Run # 1 Media (mV) Ejecutar # 2 Media (mV) Ejecutar # 3 Media (mV)
(+) Ctrl 2255 (+) Ctrl 1655 (+) Ctrl 2115
(+) Ctrl adj. 1000 (0.443) (+) Ctrl adj. 1000 (0.604) (+) Ctrl adj. 1000 (0.473)

Multiplicando por la relación de corrección dentro de cada experimento, los valores para el compuesto A y el compuesto B se ajusta entonces.

Run # 1 Adj. GAE (mV) Ejecutar # 2 Adj. GAE (mV) Ejecutar # 3 Adj. GAE (mV)
Un Cmpnd 1094 Un Cmpnd 1054 Un Cmpnd 1197
Cmpnd B 828 Cmpnd B 752 Cmpnd B 780

Los promedios (medias) para cada compuesto se determina a continuación junto con otros datos estadísticos pertinentes y las respuestas EAG para los compuestos ensayados, a continuación, se puede evaluara la candidatura para una mayor investigación.

Compuesto GAE (mV) N º Corre, N =
A 1115 3
B 787 3

figure-protocol-1
Figura 1. EAG Representante para la respuesta masculina antenal (1180 mV) a la pre-control (1 º de hojaldre control positivo) que se descarta debido a la respuesta antenal pobres después de asegurarse de las antenas tienen un buen contacto con el gel. Las barras azules en las ventanas de la parte inferior representan la hojaldre dos segundos de la volatilidad. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

figure-protocol-2
Figura 2. EAG Representante para la respuesta de las hembras antenal (3400 mV) a la 1 ª bocanada de pre-control que se considere apropiada. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

figure-protocol-3
Figura 3. EAG Representante para la respuesta de las hembras antenal (1680 mV) para el control a posteriori (último control positivo para cada experimento) que se considera pobre, y sugerente de las antenas de la degradación (<75% del 1 de pre-control o < 2 º valor bocanada de pre-control). Para este ejemplo, el 1 º de pre-control de hojaldre era 2.730 mV y 2 º de pre-control de hojaldre era 2350 mV. Haga clic aquí para ver más grande la figura .

figure-protocol-4
Figura 4. Representante EAG para la respuesta de las hembras antenal (3800 mV) a la nube de una mezcla volátil y candidato a las mediciones sucesivas de la desviación máxima inicial (3800 mV), la pendiente inicial, durante la duración de hojaldre (0,3 mV = s/1.2 0,25 s / mV), y la pendiente de la duración restante de hojaldre (1,6 s/1.9 mV = 0,84 s / mV). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

figure-protocol-5
Figura 5. Pequeño vaso modificado que contiene una matriz de muestra y los volátiles asociados a ser inflado a través de A. transitella antenas.

figure-protocol-6
Tabla 1. En sUIT volátiles de emisiones de almendras sin par (2007) y las respuestas EAG determinados por una configuración diferente y menos sensibles en el programa Autospike.

figure-protocol-7
Tabla 2. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas antenales hombres y mujeres a los distintos componentes volátiles.

figure-protocol-8
Tabla 3. Ejemplo de un formulario para el registro de las respuestas de las antenas de ambos sexos a las mezclas volátiles y / o ramos de flores.

figure-protocol-9
Tabla 4. Ejemplos de preparación de 10 ml de una dosis de 5 mg / ml de solución para dos diferentes proporciones de las mezclas.

figure-protocol-10
Tabla 5. Ejemplo de formulario para registrar dos consecuenciascutivo inhalaciones individuales de los componentes volátiles a través de antenas de los machos y hembras.

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Discusión

El uso de grabaciones electroantenograma como un bioensayo para determinar las respuestas Quimiorecepción de un insecto objetivo es bastante común y numerosos estudios que utilizan GAE como un detector para el efluente de un cromatograma de gases (GC-EAD) se pueden encontrar en la literatura. 9,10 El método demostró proporcionará una detección rápida de cantidades equivalentes de los componentes volátiles con repeticiones altas para la asignación de confianza de la capacidad de respuesta relativa. El programa...

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Divulgaciones

El autor cuenta con una investigación existente de cooperación y acuerdo de desarrollo con Paramount Farming Company, una compañía con vínculos con Suterra LLC.

Agradecimientos

Esta investigación se llevó a cabo en virtud de USDA-ARS CRIS Proyecto de 5.325 a 42.000-037-00D, y con los resultados de CRADA 58-3K95-7-1198 y TFCA 58-5325-8-419. Los autores agradecen Suterra por el don de la (Z, Z) -11,13-hexadecadienal, B. Higbee de discusiones productivas, y J. Baker, de asistencia técnica.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
Acetofenona Alfa-Aesar A12727 Control positivo Mujer
(Z, Z) -11,13-Hexadecadienal Suterra Control positivo Mujer
α-humuleno Aldrich 53675 Sesquiterpénicas
2-undecanona Aldrich U1303 Derivado de ácido graso
2-feniletanol Aldrich 77861 Bencenoide
Pentano EMD PX0167-1 Solvente
4 canales de adquisición de control Syntech YoCAD-4
GAE sonda, pre-amplificador Syntech Tipo de PRG-2
Antena titular de la Syntech Para PRG-2 Tenedor de electrodos
Estímulo del controlador Syntech CS-55 El flujo de aire y bocanadas
Spectra gel para electrodos Parker 12-02
Los discos de bioensayo Whatman 2017-006 6 mm
Pasteur Pipetas VWR 14673-010 5 ¾ "(14,6 cm)
Parafilm M Bemis AM-992

Referencias

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