Generación de linfocitos T de madre pluripotentes inducidas (iPS) a las células da un enfoque alternativo de la utilización de células madre embrionarias para células T basada en la inmunoterapia. El método muestra que mediante la utilización de cualquiera In vitro O En vivo Sistema de inducción, las células iPS son capaces de diferenciarse en los linfocitos T, tanto convencionales como antígeno específico.
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Artículo de método
Diferenciación dirigida de células madre pluripotentes inducidas hacia los linfocitos T
En este artículo
Resumen
Resumen
La transferencia de células adoptivo (ACT) de antígenos específicos de células CD8 + linfocitos T citotóxicos (CTL) es un tratamiento prometedor para una variedad de tumores malignos 1. CTL puede reconocer las células malignas mediante la interacción con los antígenos tumorales receptores de células T (TCR), y citotoxinas liberación de citoquinas, así como para matar las células malignas. Se sabe que menos disociados y central-memoria como-(denominado altamente reactivo) CTL son la población óptima para ACT basado en inmunoterapia, porque estos CTL tienen un potencial proliferativo alta, son menos propensos a la apoptosis que las células más diferenciadas y tienen un mayor capacidad para responder a las citoquinas homeostáticos 2-7. Sin embargo, debido a las dificultades en la obtención de un elevado número de linfocitos T citotóxicos tales de los pacientes, hay una necesidad urgente de encontrar un nuevo enfoque para generar altamente reactivos Ag-CTLs específicos para el éxito a base de ACT-terapias.
TCR transducción del vástago auto-renovablecélulas para la reconstitución inmune tiene un potencial terapéutico para el tratamiento de enfermedades 8-10. Sin embargo, el enfoque para obtener células madre embrionarias (CME) de los pacientes no es factible. Aunque el uso de células madre hematopoyéticas (HSC) con fines terapéuticos ha sido ampliamente aplicado en la clínica de 11-13, las CMH se han reducido la capacidad de diferenciación y proliferación, y las CMH son difíciles de crecer en cultivo celular in vitro 14-16. La tecnología reciente de células iPS y el desarrollo de un sistema in vitro para la entrega de genes son capaces de generar células iPS de pacientes sin ningún tipo de abordaje quirúrgico. Además, como CME, las células iPS poseen la capacidad proliferativa indefinida in vitro, y se ha demostrado que se diferencian en células hematopoyéticas. De este modo, las células iPS tienen un mayor potencial para ser utilizado en el ACT basado en inmunoterapia en comparación con los CES o HSCs.
Aquí, se presentan métodos para la generación de linfocitos Tcitos de las células iPS in vitro y en vivo de la programación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos de las células iPS para la promoción de la vigilancia del cáncer inmunológico. La estimulación in vitro con un ligando muesca impulsa la diferenciación de células T a partir de células iPS, y TCR resultados de transducción de genes en células iPS diferenciadores en antígenos específicos de células T in vivo, lo cual impide el crecimiento del tumor. De este modo, demostramos antígeno específico de la diferenciación de células T a partir de células iPS. Nuestros estudios proporcionan un enfoque potencialmente más eficientes para la generación de antígenos específicos de linfocitos T citotóxicos para las terapias basadas en ACT y facilitar el desarrollo de estrategias terapéuticas para las enfermedades.
Protocolo
1. Cultivo Celular
- Preparación de células alimentadoras irradiados SNL76 / 7 (irSNL76 / 7) para el cultivo.
SNL76 / 7 células generalmente se mantienen en 10% de suero fetal bovino (SFB) de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) medios de comunicación.- Un plato de cultivo o matraz se recubre con un 0,1% de solución de gelatina en 37 ° C; incubadora durante 30 minutos antes de recuperarse SNL76 / 7 células de nitrógeno líquido.
- Cuando SNL76 / 7 células alcanzan la confluencia, las células se tripsinizaron apagado, se centrifuga a 400 g durante 5 min y se resuspendieron en medio fresco.
- Resuspendidas SNL76 / 7 células se irr....
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Discusión
Para ACT terapias basadas en la generación in vitro de un gran número de Ag altamente reactivos específicos de las células T in vivo para la re-perfusión es una solución óptima. Aunque nuestro método in vitro da lugar funcional de las células T a partir de células iPS, un gran número de células iPS derivadas de las células mueren en cuatro semanas, sobre todo en la cuarta semana. Se concluye que las señales de supervivencia de señalización Notch mediada por el DL1 así como la IL-7 y Flt3.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Shinya Yamanaka (Universidad de Kyoto) para proporcionar iPS-MEF-Ng-20D-17 línea celular, el Dr. Darío Vignali (Hospital St. Jude Childrens Research) para apoyar la OT1-2A • pMig II construcción, el Dr. Juan Carlos Zúñiga Pflucker (Departamento de Inmunología de la Universidad de Toronto) para el apoyo a la línea celular OP9-DL1, y el Dr. Kent Vrana E (Departamento de Farmacología de la Universidad de Penn State College of Medicine) para ayudar al diseño de este estudio. Este proyecto está financiado, en virtud de concesiones con el número de concesión K18CA151798 del Instituto Nacional del Cáncer, la Fundación Barsumian y el Melanoma Research Foun....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| C57BL/6J ratones | Jackson Laboratory | 000664 | |
| B6.129S7-Rag1 tm1Mom / J | Jackson Laboratory | 002216 | |
| Anti-CD3 (2C11) anticuerpo | BD PharMingen | 553058 | |
| Anti-CD28 (37,51) de anticuerpos | BD PharMingen | 553295 | |
| Anti-CD3 (17A2) de anticuerpos | BioLegend | 100202 | |
| Los anti-CD4 (GK1.5) de anticuerpos | BioLegend | 100417 | |
| Anti-CD8 (53-6,7) de anticuerpos | BioLegend | 100714 | |
| Anti-CD25 (3C7) de anticuerpos | BioLegend | 101912 | |
| Unti-CD44 (1M7) de anticuerpos | BioLegend | 103012 | |
| Anti-CD117 (2B8) de anticuerpos | BioLegend | 105812 | |
| Anti-TCR-β (H57597) de anticuerpos | BioLegend | 109220 | |
| Anti-IL-2 (JES6-5H4) anticuerpo | BioLegend | 503810 | |
| Anti-IFN-γ (XMG1.2) de anticuerpos | BioLegend | 505822 | |
| DMEM | Invitrogen | ABCD1234 | |
| α-MEM | Invitrogen | A10490-01 | |
| FBS | HyClone | SH3007.01 | |
| Un Brefeldin | Sigma | B7651 | |
| Polybrene | Sigma | 107689 | |
| GeneJammer | Integrado de Ciencias | 204130 | |
| ARN kit | Qiagen | 74104 | |
| ADN kit | Qiagen | 69504 | |
| CD8 kit de aislamiento | Miltenyi Biotec | 130-095-236 | |
| Tampón de lisis ACK | Lonza | 10-548E | |
| mFlt-3L | PeproTech | 250-31L | |
| mIL-7 | PeproTech | 217-17 | |
| Gelatina | Sigma | G9391 | |
| FITC anti-OVA anticuerpo | Rockland Immunochemicals | 200-4233 | |
| Permeabilización de amortiguación | BioLegend | 421002 | |
| BSA | Sigma | A7906 | |
| Formaldehído | Sigma | F8775 | |
| 0,4 m de filtro | Millipore | ||
| MoFlo clasificador de células | Dake Cytomation | ||
| Calibur citómetro de flujo | BD | ||
| LSR II citómetro de flujo | BD | ||
| Ratón inmovilización | Braintree Científico |
Referencias
- Brenner, M. K., Heslop, H. E. Adoptive T cell therapy of cancer. Curr. Opin. Immunol. 22, 251-257 (2010).
- Hataye, J., Moon, J. J., Khoruts, A., Reilly, C., Jenkins, M. K. Naive and memory CD4+ T cell survival controlled by clonal abundance. Science. 312, 114-116 (2006).
- Se....
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Reimpresiones y permisos
