Se describe un reportero de ensayo de fluorescencia para identificar rápidamente y caracterizar los genes que regulan el mantenimiento de embriones de ratón con células madre y auto-renovación.
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Artículo de método
Oct4GiP reportero de ensayo para estudiar los genes que regulan la de embriones de ratón con células madre de mantenimiento y auto-renovación
En este artículo
Resumen
Resumen
Pluripotencia y auto-renovación son dos características que definen a las células madre embrionarias (células ES). Entender el mecanismo molecular subyacente facilitará en gran medida el uso de células madre embrionarias para los estudios de biología del desarrollo, modelos de enfermedades, descubrimiento de fármacos y Medicina Regenerativa (revisado en 1,2).
Para agilizar la identificación y caracterización de nuevos reguladores de mantenimiento de células ES y auto-renovación, hemos desarrollado un reportero de fluorescencia de base de ensayo para medir cuantitativamente el estado de auto-renovación en células madre embrionarias de ratón usando las células Oct4GiP 3. Las células Oct4GiP expresar la proteína verde fluorescente (GFP) bajo el control de la región promotora del gen Oct4 4,5. Oct4 se requiere para células ES de auto-renovación, y es altamente expresado en células madre embrionarias y rápidamente regulado a la baja durante la diferenciación 6,7. Como resultado, la expresión de GFP y fluorescencia en las células informadoras se correlaciona fielmentecon la identidad de células ES 5, y activado por fluorescencia de células de clasificación (FACS) el análisis se puede utilizar para controlar estrechamente el estado de auto-renovación de las células en el nivel de células individuales 3,8.
Junto con ARNi, el ensayo reportero Oct4GiP se puede utilizar para identificar rápidamente y estudiar los reguladores de mantenimiento de células ES y autorrenovación 3,8. En comparación con otros métodos para el ensayo de auto-renovación, es más conveniente, sensible, cuantitativa, y de menor coste. Puede llevarse a cabo en 96 - o placas de 384-bien para estudios a gran escala, tales como pantallas de alto rendimiento o de análisis de epistasis genética. Finalmente, mediante el uso de otros linaje específico reportero líneas de células ES, el ensayo se describe aquí también se puede modificar para estudiar especificación destino durante la diferenciación de células ES.
Protocolo
1. Oct4GiP madre embrionarias de ratón de mantenimiento de la célula
Oct4GiP células fueron amablemente proporcionados por el Dr. Austin Smith. Se deriva de los ratones portadores 129/Ola un transgén Oct4-GFPiresPac 4,5. Ellos se mantienen en gelatina placas recubiertas de cultivo de tejidos en el medio ESGRO grado completa más clonal (Millipore), o en el medio M15: DMEM (Invitrogen) suplementado con FBS al 15%, 1000 U / ml ESGRO (Millipore), 1x para no- aminoácidos esenciales (Invitrogen), 1x Nucleasides EmbryoMax (Millipore), y 10 mM mercaptoetanol β-.
- Coat con placas% de gelatina 0,1 (Sigma) a temperatura ambiente....
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Discusión
El reportero de ensayo Oct4GiP que describimos arriba cuantitativamente se puede medir el grado de auto-renovación frente a la diferenciación. En comparación con otros métodos disponibles, tales como la morfología 12 basada en la proliferación y / ensayos de viabilidad basado, que ofrece una mayor sensibilidad y el rendimiento, así como una medición más directa del estado de células ES. Por tanto, se adapta bien a gran escala pantallas y análisis epistasis genética. De hecho, nosotros y otros han utilizado co.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a Brad Lackford para la lectura y edición del manuscrito. Esta investigación fue apoyada por el Instituto Nacional de Ciencias de Salud Ambiental, Institutos Nacionales de Salud, Programa de Investigación Intramural Z01ES102745 (GH).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| ESGRO de grado medio, y además de clonal | Millipore | SF001-500P | |
| DMEM (glucosa alta 1X) | Invitrogen | 11965 | |
| 0,25% de tripsina-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 1001817 | |
| OPTI-MEM (reducir medio de suero) | Invitrogen | 31985 | |
| ESGRO primer fondo (10 7 units/1ml) | Millipore | DAM1776540 | |
| MEM AANE (no aminoácidos esenciales) | Invitrogen | 11140 | |
| Nucleósidos 100X para células ES | Millipore | 10620-1 | |
| 2-mercaptoetanol | Sigma | M7522-100 ml | |
| ES-calificado de suero fetal bovino | Invitrogen | 10437 | |
| Nanog siRNA | Invitrogen | MSS231181 | |
| Oct4 siRNA | Dharmacon | D-046256-02 | |
| Sox2 siRNA | Dharmacon | M-058.489-01 |
El control de siRNA: dúplex siRNA dirigidos a la luciferasa de luciérnaga (5'-CGTACGCGGAATACTTCGA) sintetizados por Dharamcon.
Referencias
- Keller, G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 19, 1129-1155 (2005).
- Murry, C. E., Keller, G. Differentiation of embryonic stem cells to clinically relevant populations: l....
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Reimpresiones y permisos
