La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata

Resumen

Se describe la preparación del factor de crecimiento de las células T utilizados para la expansión in vitro de antígenos específicos de las líneas de linfocitos T de rata.

Resumen

Mantenimiento de antígeno específico de líneas de células T o clones de la cultura requiere rondas de antígeno de la activación inducida por separado por las fases de expansión celular ^1,2. Además de la interleucina 2 a los medios de cultivo durante la fase de expansión es necesaria para prevenir la muerte celular y suficiente para mantener a corto plazo líneas de células T, pero se ha demostrado que aumenta la polarización Th1 ^3. Sustitución de la interleucina 2 por el factor de crecimiento de las células T (TCGF), que contiene una mezcla de citoquinas es más eficaz que la interleucina 2 en el mantenimiento a largo plazo las líneas de células T in vitro ^3. Por otra parte, TCGF se pueden preparar fácilmente en grandes cantidades en el laboratorio y es mucho más barato que la interleucina 2 recombinante.

Aquí, se muestra cómo preparar TCGF a partir de sobrenadantes de esplenocitos de ratas cultura. Para este procedimiento, se cosecha el bazo de ratas Lewis ingenuo sacrificados por el timo y la extracción de sangre. Preparamos una sola célula suspensiones de los bazos, Lyze los glóbulos rojos por choque osmótico, y las semillas de los esplenocitos en medio de cultivo. Las células son estimuladas con concanavalina A, un mitógeno que no activa selectivamente los linfocitos T de rata, que induce la producción de citoquinas. El sobrenadante se recoge la cultura 48 horas más tarde andexcess concanavalina A se une a la alfa metil mannoside para evitar la activación de líneas de células T a la que se añadirá TCGF. El TCGF entonces esterilizada por filtración, alícuotas, y almacenadas a -20 ° C.

Protocolo

1. Tome el bazo de ratas Lewis (ratas entre 160-200g son los mejores). Dilacerate sobre el hielo en un plato de Petri que contiene PBS + antibióticos (PBS-PS) con un filtro de la célula. Poner en un tubo de 50 ml. Rellenar con PBS-PS.
2. Girar durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células.
3. Lavar las células dos veces.
4. Resuspender el precipitado en NH ₄ Cl 0,15 M (5 ml por bazo). Mezclar suavemente y de forma continua con una pipeta de 3 minutos sobre el hielo para lisar los eritrocitos. Llenar el tubo con el medio.
5. Girar durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células.
6. Lavar las células dos veces.
7. Contar las células. Un bazo de ratas da 200-250 million células.
8. Sembrar las células en 2 millones por ml en medio completo: 50 ml por cada 75 ^cm2.
9. Se dejó crecer durante 48 horas en la incubadora.
10. Giro 15 min a 4 ° C para precipitar las células.
11. Recoger el sobrenadante; deshacen de las células.
12. Añadir 15 mg / ml a mannoside de metilo para el sobrenadante. Mezclar bien.
13. Filtro (0,2 mm)
14. Alícuota y almacenar a -20 ° C. Puede mantenerse a 4 ° C durante 10 días si es necesario.

Discusión

Preparamos TCGF a partir de esplenocitos de ratas Lewis ya que regularmente la eutanasia a las ratas ingenuo de esta cepa de la cosecha de suero y thymi para estimular Lewis rata líneas de células T in vitro. Este TCGF se puede utilizar para promover el crecimiento y la supervivencia de las líneas de células T a partir de cepas de ratas otros. TCGF también puede ser preparado a partir de otras cepas de ratas.

Materiales