Se describe la preparación del factor de crecimiento de las células T utilizados para la expansión in vitro de antígenos específicos de las líneas de linfocitos T de rata.
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Artículo de método
La preparación de Factor de Crecimiento Celular T a partir de esplenocitos de rata
En este artículo
Resumen
Resumen
Mantenimiento de antígeno específico de líneas de células T o clones de la cultura requiere rondas de antígeno de la activación inducida por separado por las fases de expansión celular 1,2. Además de la interleucina 2 a los medios de cultivo durante la fase de expansión es necesaria para prevenir la muerte celular y suficiente para mantener a corto plazo líneas de células T, pero se ha demostrado que aumenta la polarización Th1 3. Sustitución de la interleucina 2 por el factor de crecimiento de las células T (TCGF), que contiene una mezcla de citoquinas es más eficaz que la interleucina 2 en el mantenimiento a largo plazo las líneas de células T in vitro 3. Por otra parte, TCGF se pueden preparar fácilmente en grandes cantidades en el laboratorio y es mucho más barato que la interleucina 2 recombinante.
Aquí, se muestra cómo preparar TCGF a partir de sobrenadantes de esplenocitos de ratas cultura. Para este procedimiento, se cosecha el bazo de ratas Lewis ingenuo sacrificados por el timo y la extracción de sangre. Preparamos una sola célula suspensiones de los bazos, Lyze los glóbulos rojos por choque osmótico, y las semillas de los esplenocitos en medio de cultivo. Las células son estimuladas con concanavalina A, un mitógeno que no activa selectivamente los linfocitos T de rata, que induce la producción de citoquinas. El sobrenadante se recoge la cultura 48 horas más tarde andexcess concanavalina A se une a la alfa metil mannoside para evitar la activación de líneas de células T a la que se añadirá TCGF. El TCGF entonces esterilizada por filtración, alícuotas, y almacenadas a -20 ° C.
Protocolo
- Tome el bazo de ratas Lewis (ratas entre 160-200g son los mejores). Dilacerate sobre el hielo en un plato de Petri que contiene PBS + antibióticos (PBS-PS) con un filtro de la célula. Poner en un tubo de 50 ml. Rellenar con PBS-PS.
- Girar durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células.
- Lavar las células dos veces.
- Resuspender el precipitado en NH 4 Cl 0,15 M (5 ml por bazo). Mezclar suavemente y de forma continua con una pipeta de 3 minutos sobre el hielo para lisar los eritrocitos. Llenar el tubo con el medio.
- Girar durante 10 minutos a 4 ° C para precipitar las células.
- Lavar las células dos veces.
- Contar las células. Un bazo de ratas da 200-250 million células.
- Sembrar las células en 2 millones por ml en medio completo: 50 ml por cada 75 cm2.
- Se dejó crecer durante 48 horas en la incubadora.
- Giro 15 min a 4 ° C para precipitar las células.
- Recoger el sobrenadante; deshacen de las células.
- Añadir 15 mg / ml a mannoside de metilo para el sobrenadante. Mezclar bien.
- Filtro (0,2 mm)
- Alícuota y almacenar a -20 ° C. Puede mantenerse a 4 ° C durante 10 días si es necesario.
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Discusión
Preparamos TCGF a partir de esplenocitos de ratas Lewis ya que regularmente la eutanasia a las ratas ingenuo de esta cepa de la cosecha de suero y thymi para estimular Lewis rata líneas de células T in vitro. Este TCGF se puede utilizar para promover el crecimiento y la supervivencia de las líneas de células T a partir de cepas de ratas otros. TCGF también puede ser preparado a partir de otras cepas de ratas.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Materiales
Para preparar el medio de cultivo completo agregar lo siguiente a una botella de 500 ml de RPMI 1640 y estéril filtro: FCS al 10%, una botella de PSG, 5 ml de RPMI vitaminas, 5 ml de piruvato de sodio, 5 ml no aminoácidos esenciales; 50 uM beta-mercaptoetanol, 2 ug / ml Concanavalina A.
Referencias
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. 166, 936-944 (2001).
- Beeton, C., Wulff, H., Barbaria, J., Clot-Faybesse, O., Pennington, M., Bernard, D., Cahalan, M. D., Chandy, K. G., Beraud, E. Selective blockade of T lymphocyte K+ channels ameliorates experimental autoimmune encephalomyelitis, a model for multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. 98, 13942-13947 (2001).
- Mor, F., Cohen, I. R. Propagation of Lewis rat encephalitogenic T cell lines: T-cell-growth-factor is superior to recombinant IL-2. J. Neuroimmunol. 123, 76-82 (2002).
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Reimpresiones y permisos
