Purificación por afinidad de los complejos de ribonucleoproteína Influenza Virus de la cromatina de las células infectadas

Resumen

Los virus de influenza replicar su genoma de ARN, en asociación con la cromatina de la célula huésped. A continuación, presentamos un método para purificar intactas ribonucleoprotein complejos virales de la cromatina de las células infectadas. Purificada complejos virales pueden ser analizados por tanto Western blot y extensión del cebador de contenido de proteínas y ARN, respectivamente.

Resumen

Como todos los virus negativo-hebra de ARN, el genoma de los virus de influenza está empaquetado en forma de complejos de ribonucleoproteína (vRNP virales), en los que se encapsidado el genoma de cadena simple por la nucleoproteína (NP), y asociado con el complejo de polimerasa trimérica consistente de la PA, PB1, PB2 y subunidades. Sin embargo, en contraste con la mayoría de los virus ARN, virus de la influenza realizar la síntesis de ARN viral en los núcleos de las células infectadas. Interesantemente, la síntesis de ARNm viral utiliza celulares pre-ARNm como cebadores, y se ha propuesto que este proceso se lleva a cabo en la cromatina ^1. Las interacciones entre la polimerasa viral y el huésped ARN polimerasa II, así como entre NP y nucleosomas huésped también se han caracterizado ^1,2.

Recientemente, la generación de virus de la influenza recombinante que codifican un Uno-estrep-Tag genéticamente fusionado al extremo C-terminal de la subunidad PB2 de la polimerasa viral (RWSN-PB2-Strep ³⁾ ha seres descrito. Estos virus recombinantes permite la purificación de PB2 que contienen complejos, incluyendo vRNPs, desde las células infectadas. Para obtener purificada vRNPs, cultivos de células infectadas, y vRNPs son purificados por afinidad a partir de lisados ​​derivados de estas células. Sin embargo, los procedimientos de lisis utilizado hasta la fecha se han basado en un paso de lisis detergente, que, a pesar de la presencia de una nucleasa general, a menudo extraer cromatina determinada único material ineficientemente.

Nuestro trabajo preliminar sugiere que una gran parte de vRNPs nucleares no se extrajeron durante la lisis celular tradicional, y por lo tanto no podría ser purificado por afinidad. Para aumentar esta eficiencia de la extracción, y para separar la cromatina se dirigía de no cromatina determinada vRNPs nucleares, hemos adaptado un protocolo de paso a paso la extracción subcelular de la influenza células infectadas por virus. En pocas palabras, este procedimiento primero separa los núcleos de la célula y, a continuación extractos solubles proteínas nucleares (aquí denominado "nucleoplasmic" fracción).El restante material nuclear insoluble se digiere con Benzonase, un ADN inespecífica / ARN nucleasa, seguido de dos pasos de extracción de sal: en primer lugar utilizando 150 mM de NaCl (denominado "CH150"), a continuación, NaCl 500 mM ("ch500") (fig. 1 ). Estos pasos de extracción de sal fueron elegidos en base a nuestra observación de que 500 mM de NaCl fue suficiente para solubilizar el 85% de vRNPs nucleares y aún así permitir la unión de vRNPs etiquetados a la matriz de afinidad.

Después de fraccionamiento subcelular de las células infectadas, es posible purificar por afinidad vRNPs PB2-etiquetados de cada fracción individual y analizar su proteína y componentes de ARN utilizando Western Blot y extensión del cebador, respectivamente. Recientemente, hemos utilizado este método para descubrir que las exportaciones vRNP forma de complejos en los puntos finales después de la infección en la fracción de la cromatina se extrajo con 500 mM de NaCl (ch500) ^3.

Protocolo

Un diagrama de flujo esquemático del protocolo se muestra en la fig. 1 y una tabla de los reactivos se presentan a continuación.

1. Infección (16 - 24 h)

1. Semilla a las células HeLa en 5 150 mm platos de plástico de cultivo de células en un medio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM)-medio-alto de glucosa, de tal manera que alcanzará aproximadamente el 80% de confluencia al día siguiente (aproximadamente 5 x 10 ⁸ células). Es importante que las células no llegan a 100% de confluencia.
2. Al día siguiente, se diluye la Strep-etiquetados stock de virus de la gripe en salina tamponada con f....

Discusión

Aunque muchos estudios han identificado recientemente las proteínas individuales o de redes celulares implicados en la infección por el virus de la influenza ^8, el significado funcional de la mayoría de estas interacciones aún no está claro. Dada la dependencia absoluta de la cromatina a base de funciones para la síntesis de ARN del virus de influenza y la compleja naturaleza biofísica y bioquímica del núcleo ^9, nuevas técnicas se requieren para dilucidar estas funciones. El fraccionamiento subnucl.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
DMEM-alta glucosa	Gibco	11965-092
BSA	Sigma	A9418
Inhibidor de la proteasa mezcla G	Serva	39101
Benzonase nucleasa	Novagen	71206	25 U / l
DNasa I, libre de RNasa	ThermoScientific	EN0523	50 U / l
Homogeneizador Dounce	Wheaton	432-1271	Utilice el tipo "B" maja
Strep-Tactin Sepharose	IBA GmbH	2-1201-025	50% formato de columna suspensión también se puede utilizar
Destiobiotina	IBAGmbH	2-1000-002