Artículo de método

Grabación óptica de la actividad neural suprathreshold con la resolución de una sola célula y único punta-

DOI:

10.3791/4052

5 de septiembre de 2012

En este artículo

Resumen

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La comprensión de la función del sistema nervioso central de vertebrados requiere grabaciones de muchas neuronas porque la función cortical surge en el nivel de las poblaciones de neuronas. Aquí se describe un método óptico para registrar la actividad neuronal con suprathreshold resolución unicelular y único punta-, vaciló al azar escaneado en acceso. Este método graba somáticas fluorescencia señales de calcio de hasta 100 neuronas con alta resolución temporal. Un algoritmo de máxima probabilidad deconvolves la actividad neural subyacente suprathreshold partir de las señales de fluorescencia de calcio somáticas. Este método detecta de forma fiable con los picos de alta eficiencia de detección y una baja tasa de falsos positivos y se puede utilizar para estudiar las poblaciones neuronales In vitro Y In vivo.

Resumen

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Señalización de información en el sistema nervioso central de vertebrados se realiza a menudo por las poblaciones de neuronas en vez de las neuronas individuales. También propagación de la actividad suprathreshold spiking implica poblaciones de neuronas. Los estudios empíricos que abordan directamente la función cortical por lo tanto requieren las grabaciones de las poblaciones de neuronas con alta resolución. Aquí se describe un método óptico y un algoritmo de deconvolución para registrar la actividad neuronal de hasta 100 neuronas con resolución unicelular y único punta-. Este método se basa en la detección de los aumentos transitorios en la concentración intracelular de calcio somático asociado con picos suprathreshold eléctricas (potenciales de acción) en las neuronas corticales. Alta resolución temporal de las grabaciones ópticas se consigue mediante una técnica de escaneo rápido de acceso aleatorio utilizando deflectores acústico-ópticos (ordenadores delegados) 1. Excitación de dos fotones de los resultados sensible al calcio de tinte en una alta resolución espacial en tis cerebrales opacosdemandar 2. Reconstrucción de los picos de las grabaciones de fluorescencia de calcio se consigue mediante un método de máxima probabilidad. Simultáneas registros electrofisiológicos y óptica indican que nuestro método detecta de forma fiable espigas (> 97% de eficiencia de detección de pico), tiene una baja tasa de detección de falsos positivos espiga (<0,003 espigas / s), y una alta precisión temporal (aproximadamente 3 ms) 3. Este método óptico de detección de pico puede utilizarse para registrar la actividad neuronal in vitro y en animales anestesiados in vivo 3,4.

Protocolo

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1. Configuración óptica (Figura 1)

  1. Para dos fotones de excitación un sistema de infrarrojos láser pulsado con pulsos de femtosegundos se utiliza. Un láser de potencia de salida alta (en algunos casos> 2W en longitud de onda nm 890) es necesaria para compensar las grandes pérdidas introducidas por los componentes ópticos del sistema.
  2. Un sistema prechirper que consta de dos prismas imparte una dispersión grupo velocidad negativa (EVI) en los pulsos de láser antes de los deflectores acústico-ópticos (ordenadores delegados) para compensar la dispersión temporal introducida por el ordenadores delegados 1.
  3. Dos ordenadores delegados....

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Discusión

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Dithered azar escaneado en acceso indirecto detecta actividad suprathreshold adición de los incrementos en el calcio intracelular somático asociado con cada aumento en una somata neurona. Los incrementos en el calcio intracelular se detecta por los colorantes de calcio fluorescentes. Las limitaciones de interpolado de acceso aleatorio escaneado surgen en gran medida de la de la limitada señal-a-ruido de las señales de fluorescencia de calcio. La relación de señal-a-ruido es a su vez limitada por fotodaño, que no permite.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Agradecemos al Dr. Randy Chitwood para la lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Whitehall y la Alfred P. Sloan Foundation otorga a HJK.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
Los componentes ópticos se enumeran en orden, empezando por el láser
Titan: Sapphire láser Coherente Inc. Camaleón Ultra 2 Alta potencia de salida recomendado (> 2 W a 900 nm)
Lente acromático f = 30 mm Thor laboratorios AC254-030-B Anti-reflejo (AR) 650-1050 nm para
Lente acromático f = 100 mm Thor laboratorios AC254-100-B AR 650-1050 nm
Objetivo f = 75 mm Thor laboratorios LA1608-B AR 650-1050 nm
Objetivo f = 175 mm Thor laboratorios LA1229-B AR 650-1050 nm
Lente acromático f = 300 mm Thor laboratorios AC254-300-B AR 650-1050 nm
Lente acromático f = 100 mm Thor laboratorios AC254-100-B AR 650-1050 nm
Lente acromático f = 100 mm Thor laboratorios AC254-100-B AR 650-1050 nm
Acústico-óptico deflectores Intraaction Corp ATD 6510CD2
Rejilla de difracción reflectante Newport 53-011R 100 surcos / mm para los ordenadores delegados con ancho de banda de 65 MHz ángulo de exploración de 45 mrad
21,6 mm Brewster prismas Lambda Investigación Optics Inc. IBP21.6SF10
Vidrio coloreado Schott BG-39
Espejo dicroico Chroma Technology Corp Z532RDC
Módulos fotomultiplicadores Hamamatsu H9305-03
DAC-ADC bordo National Instruments PCI-6115
Oregon Green 488 Bapta-1 AM Invitrogen O-6807

Referencias

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  1. Iyer, V., Hoogland, T. M., Saggau, P. Fast functional imaging of single neurons using random-access multiphoton (RAMP) microscopy. J. Neurophysiol. 95, 535-545 (2006).
  2. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science<....

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Resoluci n a nivel de c lula nicaim genes de calcioexcitaci n de dos fotonesescaneo de acceso aleatorioalgoritmo de deconvoluci ndetecci n de espigasmicroscop a de fluorescencia

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