Identificación de los complejos de proteínas en Escherichia coli La purificación mediante afinidad del péptido secuencial en combinación con espectrometría de masas tándem

Summary

La purificación por afinidad de las proteínas etiquetadas en combinación con espectrometría de masas (APMS) es un potente método para la asignación sistemática de las redes de interacción de proteínas y para la investigación de la base mecánica de los procesos biológicos. A continuación, se describe un péptido secuencial optimizado afinidad (SPA) APMS procedimiento desarrollado por la bacteria Escherichia coli Que se puede utilizar para aislar y caracterizar proteínas estables de múltiples complejos a cerca de homogeneidad incluso partiendo de bajo número de copias por célula.

Abstract

Como la mayoría de los procesos celulares están mediadas por las asambleas macromoleculares, la identificación sistemática de las interacciones proteína-proteína (PPI) y la identificación de la composición de la subunidad de multi-proteína complejos pueden dar una idea de la función de genes y mejorar la comprensión de los sistemas biológicos ^{1, 2.} Interacciones físicas se pueden mapear con alta confianza vialarge escala aislamiento y caracterización de complejos de proteínas endógenas en condiciones próximas a las condiciones fisiológicas basado en la purificación por afinidad de proteínas cromosómicamente etiquetados en combinación con espectrometría de masas (APMS). Este enfoque ha sido aplicado con éxito en diversos organismos evolutivamente, incluyendo levaduras, moscas, gusanos, células de mamíferos, bacterias y ^1-6. En particular, hemos generado una afinidad carboxi-terminal del péptido secuencial (SPA) Sistema de marcado doble para los complejos de purificación por afinidad de proteínas nativas de cultivos de bacterias gram-negativas Escherichia coli, utilizando genetically-tratables cepas huésped de laboratorio que están bien adaptados para todo el genoma investigaciones de la biología fundamental y los procesos conservados de procariotas ^{1, 2, 7.} Nuestro SPA-tagging sistema es análogo al método de purificación de afinidad en tándem desarrollado originalmente para la levadura ^{8, 9,} y consta de un péptido de unión a calmodulina (CBP), seguido por el sitio de escisión para la proteasa altamente específica tabaco etch virus (TEV) y tres copias del epítopo FLAG (FLAG 3X), permitiendo por dos rondas consecutivas de enriquecimiento de afinidad. Después de la amplificación casete, específicas de secuencia lineales productos de PCR que codifican el SPA-tag y un marcador seleccionable se integran y se expresa en marco como carboxi-terminal de fusiones en un fondo DY330 que es inducida para expresar transitoriamente un muy eficiente sistema de recombinación heteróloga bacteriófago lambda ^10. Posterior de doble etapa de purificación usando calmodulina y anti-FLAG perlas de afinidad permite que el altamente selectivoy la recuperación eficaz de incluso complejos de baja abundancia de proteínas de cultivos a gran escala. La espectrometría de masas se utiliza para identificar los purificadores de manera estable co-proteínas con alta sensibilidad (bajos límites de detección de nanogramos).

A continuación, describimos detalladas paso a paso los procedimientos que comúnmente se utilizan para el etiquetado sistemático de proteínas, purificación y espectrometría de masas basado en el análisis de complejos de proteínas solubles de E. coli, que pueden ser ampliadas y potencialmente adaptado a otras especies bacterianas, incluyendo ciertos patógenos oportunistas que son susceptibles de recombinería. Las interacciones físicas resultantes a menudo pueden revelar interesantes componentes y conexiones inesperadas que sugieren nuevos enlaces mecánicos. La integración de los datos de PPI con alternativas datos de la asociación molecular, tales como genéticos (gen-gen) las interacciones y el contexto genómico-(GC) predicciones pueden facilitar la elucidación de la organización mundial molecular de los complejos multi-proteína dentro de bivías metodológicas. Las redes generadas por E. coli se puede utilizar para obtener una perspectiva de la arquitectura funcional de los productos de genes ortólogos en otros microbios para que las anotaciones funcionales están faltando.

Protocol

1. Construcción de Genes específicos de SPA-tagging en E. DY330 coli cepa

1. El plásmido pJL148 que abarca la secuencia de ADN SPA-tag y el antibiótico kanamicina casete marcador de resistencia (Kan ^R) se utiliza como una plantilla en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) ^7. A 45 nt de genes específicos de cebador directo, que se encuentra inmediatamente aguas arriba del codón de parada del gen diana en el marco con un 27 bp ('5'-AGCTGGAGGATCCATGGAAAAGAGAAG -3) tag cebador específico, y un 45 nt de genes específicos de cebador inverso, situado inmediatamente abajo del codón de parada del gen diana en el marc....

Results

Una vez marcadas, las proteínas de cebo, que se expresan a niveles endógenos, se purifican por afinidad a partir de cultivos en fase logarítmica, las muestras se analizaron en un gel de tinción de plata para visualizar los componentes polipeptídicos individuales de los complejos estables aislados. También sometimos una segunda porción de las muestras de proteínas purificadas por afinidad a espectrometría de masas en tándem sin gel (LCMS) para identificar las secuencias polipeptídicas correspondientes. La efectividad de e.......

Discussion

Un aspecto clave del enfoque basado en SPA APMS descrito aquí es que el marcado se realiza en el contexto cromosómico natural, garantizando así la regulación de genes normales se mantiene (es decir. Cebo promotor nativo conserva, por lo tanto, los niveles de expresión no es perturbado) y nativo de manera estable asociada a complejos de proteínas se recuperan casi a los niveles endógenos. Cuestiones operón polaridad también se evitan mediante la inclusión de un promotor orientada hacia fuera en el marcador selec.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
I. Antibióticos
Kanamycin	Bioshop	#KAN201
Ampicillin	Bioshop	#AMP201
2. Terrific-Caldo medio
Bio-Tryptone	Bioshop	#TRP 402
Extracto de levadura	Bioshop	#YEX 555
Glycerol	Bioshop	#GLY 002
K2HPO4	Bioshop	#PPM 302
KH2PO4	Bioshop	#PPM 303
3. Cepa bacteriana y plásmido
DY330		Yu et al. (2000)10
pJL148		Zeghouf et al. (2004)7
4. Reactivos de PCR y Electroforesis
Taq ADN polimerasa	Fermentas	# EP0281
10 X tampón PCR	Fermentas	# EP0281
10 mM dNTPs	Fermentas	# EP0281
25 mM MgCl2	Fermentas	# EP0281
Agarose	Bioshop	# AGA002
Cargando colorante	NEB	#B7021S
Bromuro de etidio	Bioshop	# ETB444
10X Tampón TBE	Thermo Scientific	#28355
Tris Base	Bioshop	#TRS001
Ácido bórico	Bioshop	#BOR001
0.5 M EDTA (pH 8.0)	Sigma	# E6768
escalera de ADN	NEB	#N3232L
5. Kits de aislamiento y limpieza de plásmidos
Plasmid kit Midi	Qiagen	#12143
QIAquick PCR kit	Qiagen	#28104
6. Equipos de PCR y Transformación
Termociclador	BioRad	iCycler
Electroforesis en gel de agarosa	BioRad
Electroporador	Bio-Rad	GenePulser II
Cubeta de electroporación de 0,2 cm	Bio-Rad
42 ° C agitador		Innova 3100
Beckman Coulter Centrífuga TJ-25	Beckman Coulter	TS-5.1-500
32 ° C Shaker	New Brunswick Scientific, EE. UU
. 32 ° C grande Shaker	New Brunswick Scientific, EE.UU
32 ° Incubadora de placa C	Fisher Scientific
7. Electroforesis y Western blot
monómero >acrilamida fuerte, N,N'-metilenobis-acrilamida	Bio-Rad	#161-0125
Persulfato de amonio	Bioshop	# AMP001
n-butanol	Sigma	# B7906
TEMED	Bioshop	#TEM001
Whatman No. 1 papel de filtro	Fischer Scientific	#09-806A
Mini protean de 3 células	Bio-Rad	#165-3301
iBlot	Invitrogen	#IB1001
Membranas de nitrocelulosa	Bio-Rad	#162-0115
Anticuerpo monoclonal Anti-Flag M2	Sigma	#F3165
Peroxidasa de rábano picante	Amersham	#NA931V
Pre-teñido Patrones de peso molecular de proteínas	Bio-Rad	#161-0363
Reactivo de quimioluminiscencia	PIERCE	#1856136
Película de autorradiografía	Clonex Corp	#CLEC810
papel secante Quick Draw Sigma		#P7796
C2 agitador mecedora de plataforma	New Brunswick Scientific, EE. UU
Sonicator	Branson Ultrasonic	#23395
NaCl	Bioshop	#SOD001
Inhibidores de la proteasa	Roche	#800-363-5887
0.5 mM TCEP-HCl	Thermo Scientific	#20490
9. Reactivos y equipos de purificación por afinidad
0,8 x 4 cm Columna de polipropileno Bio-Rad	Bio-Rad	#732-6008
Benzonasa nucleasa	Novagen	#70746
Anti-FLAG M2 perlas de agarosa	Sigma	#A2220
Calmodulina-sefarosa	GE Healthcare	#17-0529-01
TEV proteasa	Invitrogen	#12575-015
Triton X-100	Sigma	#T9284
CaCl2	Sigma	#C2661
EGTA	Sigma	#E3889
LabQuake Shaker	Thermolyne	#59558
10. Reactivos de tinción de plata
	Metanol Bioshop	#MET302
Ácido acético	Bioshop	t#ACE222
Tiosulfato de sodio	Sigma	#S-7143
Nitrato de plata	Fischer Scientific	#S181-100
Formaldehído	Bioshop	#FOR201
Carbonato	de sodioBioshop	#SOC512
11. Reactivos y equipos para la identificación de proteínas
tripsina fuerte, espectrometría de masas grado	Promega	# V5280
50 mM NH4HCO3	Bioshop	#AMC555
1 mM CaCl2	Bioshop	#CCL302
Acetonitrilo	Sigma	#A998-4
Formic ácido	Sigma	#F0507
agua de grado HPLC	Sigma	#95304
Yodoacetamida	Sigma	#16125
Millipore Zip-Tip	Millipore	# ZTC18M960
~10 cm de 3 μ m Resina Luna-C18	Phenomenex
Proxeon nano Bomba de HPLC	Thermo Fisher Scientific
LTQ Orbitrap Velos espectrómetro		de masas Thermo Fisher Scientific
12. Material de laboratorio
Matraces cónicos de 4 litros	VWR	#89000-372
Tubos halcón de polipropileno de 50 ml	Cualquier proveedor Tubos
de microcentrífuga de 1,5 ml	Cualquier proveedor
Flaks cónicos de 250 ml	VWR	#29140-045
Tubos de cultivo estériles de 15 ml	Thermo Scientific	#366052
Viales criogénicos	VWR	#479-3221-80
° C congelador	Fisher Scientific	#13-990-14
Sistema de vacío de velocidad	Thermo Scientific
Buffers and Solutions 1. 1 litro de caldo fantástico (TB) media 11 g Bio-Tryptone 22 g Extracto de levadura 2% Glycerol 50 ml de caldo de sal potásica solución 2. Solución madre de sal de potasio 1.5 M K2HPO4 0.35 M KH2PO4 3. Tampón de sonicación 20 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 10% Glycerol Antes de usar, agregue inhibidor de la proteasa (PI) y 0,1-0,5 mM TCEP 4. Tampón AFC 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,1% detergente Antes de usar, agregue PI y 0,1-0,5 mM TCEP 5. Tampón de escisión TEV 30 mM Tris-HCl (pH 7,9) 150 mM NaCl 0,2 mM EDTA 0,1% detergente Antes de usar, añadir PI y 0,1-0,5 mM TCEP 6. Tampón de unión a calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1% detergente Antes de usar, agregue PI y 0.1-0.5 mM TCEP 7. Tampón de lavado de calmodulina 30 mM Tris-HCl pH 7.9 150 mM NaCl 2 mM CaCl2 0.1-0.5 mM TCEP 8. Tampón de elución de calmodulina 30 mM Tris-HCl (pH 7.9) 100 mM NaCl 10 mM EGTA 0.1-0.5 mM TCEP 9. Solución en desarrollo (1L) 37% Formaldehído 30 g de carbonato de sodio 1000 ml de agua destilada 10. Tampón de digestión 50 mM NH4HCO3 1 mM CaCl2 11. Solución de humectación y equilibrio 70% acetonitrilo (ACN) en ácido fórmico al 0,1% 12. Solución de lavado 100% H2O en ácido fórmico al 0,1%