Un método de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas posteriores de incubación (de más de Hamburger y Hamilton etapa (HH) 22) se describe. Este método supera las desventajas de In ovo se aplica a los embriones de pollo y de más edad es una técnica útil para estudiar la función génica y regulación de los últimos estadíos de desarrollo.
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Artículo de método
Transferencia de genes en embriones de pollo por los mayores
En este artículo
Resumen
Resumen
El embrión de pollo constituye un modelo excelente para estudiar la función génica y regulación durante el desarrollo embrionario. En la electroporación in ovo es un poderoso método para sobre-expresan genes exógenos o hacia abajo de regular los genes endógenos en vivo en 1 embriones de pollo. Las diferentes estructuras, tales como genes de ADN plásmidos que codifican 2-4, pequeños ARN de interferencia (siRNA), plásmidos 5, pequeña síntesis de ARN oligos 6, y los oligonucleótidos antisentido morpholino 7 puede ser fácilmente transfectadas en embriones de pollo por electroporación. Sin embargo, la aplicación de la electroporación in ovo en el se limita a los embriones en las fases iniciales de incubación (menor que en el estadio HH20 - de acuerdo a Hamburgo y Hamilton) 8 y hay algunas desventajas para su aplicación en los embriones en etapas posteriores (mayor que en el estadio HH22 - aproximadamente 3,5 días de desarrollo). Por ejemplo, la membrana vitelina en etapas posteriores es USUaliado pegado a la membrana debe y abrir una ventana en la cáscara provoca la ruptura de los vasos, lo que resulta en la muerte de los embriones; los embriones más viejos están cubiertos por los buques vitelino y alantoideo, donde es difícil acceder y manipular los embriones; los embriones más viejos se mueven vigorosamente y es difícil de controlar la orientación a través de una ventana relativamente pequeña en la cáscara.
En este protocolo se demuestra un método de electroporación in ovo ex de transferencia de genes en embriones de pollo en las etapas finales (más que en el estadio HH22). Para la electroporación in ovo ex, los embriones se cultivaron en placas de Petri de 9 y el vitelino y los vasos alantoideo se extendió ampliamente. Bajo estas condiciones, los embriones de pollo mayores son fácilmente accesibles y manipulado. Por lo tanto, este método supera las desventajas de electroporación in ovo en aplicar a los embriones de pollo mayores. Usando este método, los plásmidos pueden ser fácilmente transfectadas en diferentes partesde los embriones de pollo mayores 10-12.
Protocolo
1. Ex ovo Cultura
- Frescos los huevos fertilizados se colocan a su lado mucho tiempo en una incubadora de tiro forzado (BSS160, Ehret, Alemania) a 37,5 ° C con 60% de humedad para la incubación. Los huevos almacenados a 12 ° C durante más de una semana no debe ser utilizado.
- Después de la incubación durante 2,5 días (cerca de la etapa HH17), sacar los huevos y la etiqueta de la parte superior con un lápiz para indicar la dirección para la formación de grietas.
- Antes de craqueo, se vierte sobre 20 ml de agua destilada estéril en un plato limpio grande de Petri (diámetro de 145 mm; Greiner Bio-One GmbH, Alemania).
- Coloqu....
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Discusión
Este protocolo proporciona una guía para la transferencia de genes en embriones de pollo mayores (por ejemplo, en el techo óptico en E6) mediante electroporación in ovo ex. Este método se extiende el uso de electroporación para embriones de pollo mayores y puede ser fácilmente aplicado a muchos laboratorios para estudiar la función génica in vivo en etapas posteriores. Los embriones de E4 a menos E7 puede ser satisfactoriamente electroporación por este método y los embriones electroporated pue.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por una beca de la Fundación Alemana de Investigación (DFG; LU1455/1-1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | |
| Electroporador | Nepa Gene, Japón | CUY21-Edit | |
| Electrodos | Nepa Gene, Japón | CUY661-3x7 | |
| Huevo de incubadora | Ehret, Alemania | BSS160 | |
| Embriones incubadora | BINDER GmbH, Alemania | ||
| Microscopio de fluorescencia | Keyence, Deutschland GmbH | BZ-8000 | |
| Petri | Greiner Bio-One GmbH, Alemania | ||
| Microelectrodo extractor | World Precision Instruments, Alemania | PUL-100 |
Referencias
- Momose, T., Tonegawa, A., Takeuchi, J., Ogawa, H., Umesono, K., Yasuda, K. Efficient targeting of gene expression in chick embryos by microelectroporation. Dev. Growth Differ. 41, 335-344 (1999).
- Luo, J., Ju, M. J., Lin, J., Yan, X., Markus, A., Mix, E., Rolfs, A., Redies, C.
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Reimpresiones y permisos
