Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el C. elegans

Resumen

Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de O ₂ Entender las respuestas biológicas a la disminución de O ₂. Este sistema es fácil de instalar y mantener, y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una amplia gama de O ₂ Concentraciones y sistemas modelo

Resumen

El oxígeno es esencial para todos los metazoos para sobrevivir, con una sola excepción conocida ^1. Disminución de la disponibilidad de O ₂ (hipoxia) pueden surgir durante los estados de la enfermedad, el desarrollo normal o cambios en las condiciones ambientales ^2-5. La comprensión de las vías de señalización celular que están implicadas en la respuesta a la hipoxia podría proporcionar una nueva visión de las estrategias de tratamiento para diversas patologías humanas, los accidentes cerebrovasculares hasta el cáncer. Este objetivo se ha visto obstaculizada, al menos en parte, por las dificultades técnicas asociadas a la exposición controlada de hipoxia en los organismos genéticamente susceptibles modelo.

Los nematodo Caenorhabditis elegans es ideal como un organismo modelo para el estudio de respuesta hipóxica, ya que es fácil de manipular genéticamente y la cultura. Además, es posible estudiar la respuesta celular a hipoxia específicas de O ₂ concentraciones sin efectos de confusión desde C. elegans obtención de O ₂ (y otros gases) por difusión, en oposición a un sistema respiratorio facilitado ^6. Factores que se sabe están implicados en la respuesta a la hipoxia se conservan en C. elegans. La respuesta real a la hipoxia depende de la concentración específica de O ₂ que está disponible. En C. elegans, la exposición a la hipoxia moderada provoca una respuesta transcripcional mediada en gran parte por HIF-1, los altamente conservadas por la hipoxia-inducible factor de transcripción ^6-9. C. elegans embriones requieren HIF-1 para sobrevivir en 5,000-20,000 ppm de O ₂ ^7,10 . La hipoxia es un término general para "menos de lo normal de O _2". Normoxia (normal O ₂₎ también puede ser difícil de definir. En general, consideramos aire de la habitación, que es 210.000 ppm de O ₂ para ser normoxia. Sin embargo, se ha demostrado que C. elegans tiene una preferencia conductual para el O ₂ concentraciones de 5.12% (50.000-120.000 ppm O ₂₎ ^11. En larvae y adultos, HIF-1 actúa para prevenir la hipoxia inducida por la diapausa en 5000 ppm de O ₂ ^12. Sin embargo, HIF-1 no juega un papel en la respuesta a bajas concentraciones de O ₂ (anoxia, la definición operativa <10 ppm de O ₂₎ ^13. En la anoxia, C. elegans entra en un estado de animación suspendida reversible en el que toda la actividad observable al microscopio deja ^10. El hecho de que diferentes respuestas fisiológicas se producen en diferentes condiciones destaca la importancia de tener control experimental sobre la concentración de O ₂ hipóxico.

A continuación, presentamos un método para la construcción e implementación de cámaras ambientales que producen condiciones de hipoxia confiables y reproducibles, con concentraciones definidas de O _2. El método de flujo continuo asegura un rápido equilibrio de la cámara y aumenta la estabilidad del sistema. Además, la transparencia yaccesibilidad de las cámaras permiten la visualización directa de los animales estén expuestos a la hipoxia. Además, demuestran un método eficaz de recolección C. elegans muestras rápidamente después de la exposición a la hipoxia, que es necesario observar muchos de los cambios rápidamente-invertidos que se producen en la hipoxia ^10,14. Este método proporciona un fundamento básico que puede ser fácilmente modificado para las necesidades de cada laboratorio, incluidos los sistemas de modelos diferentes y una variedad de gases.

Protocolo

1. Construcción de cámaras de medio ambiente

1. Seleccione el tamaño de volumen razonable de la cámara necesarios para el alcance de su proyecto. Cámara debe estar hecha de gas (O ₂₎ material impermeable. Platos Pyrex cristalización, cajas Anaeropack o grandes acrílico fundido cajas (Ellard Instrumentación), se pueden utilizar. Hemos encontrado que 9 mm placas 50 puede encajar en un 100 x 50 placa de cristalización Kimex. Las placas de vidrio se puede utilizar como tapas para platos de cristalización Pyrex.
2. Haga un agujero en la cámara seleccionada y se ajustan con un macho de plástico Luer de conexión de la manguera púa (Cole Parmer). Accesorios, puede obtenerse mediante instalación de tuberías o con epoxi. Instalar un accesorio similar en el lado opuesto del recipiente para permitir que el gas fluya dentro y fuera de la cámara. Si es posible, compensar los agujeros para incrementar la mezcla turbulenta.
3. Obtener los tanques de gas comprimido, con definidas _{concentraciones} de O2 (en equilibrio con N ₂₎ que están certificados estándar de O _{2 CO}ntent o, en condiciones de anoxia, puro N ₂ (<10 ppm de O _2). Utilice conmutación automática reguladores de estudios a largo plazo para evitar la interrupción de los niveles de oxígeno en las cámaras.
4. Organismos respuesta a la hipoxia se ha demostrado que es dependiente de la temperatura ^15. Al colocar la cámara en una incubadora, diferentes temperaturas puede ser mantenida. Las temperaturas dentro de una incubadora puede ser desigual y, como tal, es prudente hacer uso de un registrador de datos de temperatura para medir continuamente la temperatura dentro de la cámara.

2. Conexión del gas a la Cámara del Medio Ambiente

1. Para todas las conexiones, utilice un octavo de pulgada de diámetro exterior de un tubo conectado a través de conectores rápidos, ya sea o accesorios de compresión. Tubería debe ser impermeable y no reactivo con O _2, tales como etileno propileno fluorado (FEP) o nylon (Cole Parmer). Para una vista esquemática de la instalación completa, véase la Figura 1.
2. Conecte el comprensadas tanques de gas a un dispositivo de control de flujo, tales como un controlador de flujo másico (Sierra Instruments) o rotámetro (Aalborg). Asegurarse de que la presión aguas arriba del tanque está dentro del alcance del dispositivo de flujo y los accesorios de la manguera lengüeta. Dos etapas reguladores se utilizan generalmente, con la segunda etapa establece en la presión deseada [Véase la sección tres para seleccionar la velocidad de flujo apropiado]
3. Hidrato del gas por burbujeo a través del agua destilada utilizando una botella de lavado de gas con el cilindro poroso, a continuación, directamente en uno de los accesorios en la cámara ambiental, dejando el accesorio segunda abierto para gases de escape (ver Figura 1). Para estudios a corto plazo, la hidratación de gas protege contra la desecación plato, pero el monitoreo de humedad puede ser necesario para estudios a largo plazo.
4. Dow Corning grasa de vacío se puede utilizar para sellar la cámara. Coloque pesos en la tapa de la cámara para asegurar un sello hermético. Para confirmar un cierre hermético y un flujo adecuado, mantener una pequeña piscina de agua en la palma de la mano de ynuestra mano enguantada a la conexión a cabo en la cámara y compruebe si hay burbujas.

3. Selección de velocidad de flujo

1. Suponiendo una mezcla perfecta, existe un 90% el intercambio de gases de la atmósfera gaseosa cada vez que se sustituye el volumen de la cámara (Ley de Fick). Por ejemplo, en una cámara de 100 cc con un caudal de 100 cc / min, la casa original de aire en la cámara será reemplazado con un 90% de su gas deseado después de 1 minuto, y se aproximará asintóticamente intercambio completo en un 90% cada minuto posteriormente.
2. Las mayores tasas de flujo y pequeños contenedores llegarán a su concentración deseada de oxígeno con mayor rapidez. Para 100 x 50 Kimex contenedores (400 cc), un caudal de 120 cc / min llegará a 99,9% de cambio en 10 minutos (3 intercambios). Este caudal es adecuado para la mayoría de condiciones de oxígeno. Para nuestro conocimiento no ha habido una investigación sistemática de cómo la tasa de cambio de concentración de O ₂ influye en la respuesta en C. elegans.

1. Los gusanos expuestos a condiciones hipóxicas comúnmente escapar de la superficie de placas de agar. Para evitar esto, colocar un anillo de ácido palmítico (10 mg / ml en etanol) alrededor del borde de las placas. El ácido palmítico se salgan de la solución como se evapora el etanol, formando una barrera física. Las barreras de ácido palmítico no afectar la tasa de puesta de huevos, la fecundidad o la esperanza de vida en C. elegans ^16,17. Madriguera no se produce con más frecuencia en condiciones de hipoxia, las medidas preventivas adicionales que no lo son por lo general requiere.
2. 1. Generar las poblaciones sincronizadas por el blanqueo adultas grávidas en una pequeña gota de solución de lejía alcalina de cabezas de serie de nematodos de crecimiento de los medios (NGM) placas ^18. En contraste con los protocolos estándar de hipoclorito de gran lote de blanqueo, recoger 1-100 animales en una gota de solución de cloro en la superficie de una placa de NGM, a continuación, permitir que la solución de cloro para absorber en la placa
   2. Evite la exposición de embriones blanqueados a la hipoxia, ya que esto puede reducir la viabilidad ^13. Para recoger los embriones jóvenes (2-4 células), los adultos grávidas puede ser cortada en un pequeño volumen de agua con una hoja de afeitar y los embriones se trasladó a las placas por pipeta boca para la posterior exposición a la hipoxia.
3. Sellar las placas en la cámara ambiental. Los animales de control deben mantenerse en normoxia (casa aire) a la misma temperatura que los gusanos tratados. No hay diferencia observable entre las muestras que quedan en casa aire y los mantienen en una cámara idéntica a casa aire que fluye sobre ellos. Iniciar el flujo de gas y mantener la exposición durante el tiempo deseado. Para garantizar la uniformidad en la rampa, asegúrese dereemplazar el agua de la botella de lavado de gas antes de la exposición.
4. Para la supervivencia de embriones ensayo, permita que los gusanos a desarrollar durante 48 h después de la vuelta al aire ambiente, momento en el que debe ser la cuarta etapa larvas / día uno adultos. Goles para la supervivencia, la censura de los gusanos que no pueden tenerse en cuenta.
5. Para visualizar los animales expuestos a la hipoxia, mover los gusanos a una gota de M9 en un 22 mm ² cubreobjetos, y se invierte en una almohadilla de agarosa al 2% en M9 ^18. Si el levamisol es necesario, (25 mM) o azida de sodio (10 mM) se puede utilizar como anestésico. La azida de sodio y levamisol podría confundir a algunas observaciones debido a la toxicidad y debe ser utilizada con prudencia ^19.

5. Cosecha rápida de hipoxia expuestos gusanos (por ejemplo: preparación de muestras para HIF-1 Análisis de Western)

Muchos la hipoxia inducida por los efectos se revirtieron rápidamente a su regreso al aire de la habitación, incluida la reanudación de la producción de huevos ^12, la fosforilación de epítopos mitóticasen la embriogénesis ¹³ y la degradación de la proteína HIF-1 ^9,20. Aislamiento rápido de los animales expuestos a la hipoxia se requiere para obtener los efectos reproducibles en estas condiciones. Con esta configuración, los animales pueden ser cosechadas y se congelaron en nitrógeno líquido en menos de dos minutos. Mientras que las cámaras de hipoxia caja de guantes permiten la manipulación de las muestras en condiciones de anoxia, su costo y la practicidad para fines distintos a la anoxia limitar su utilidad.

1. Crecer Bristol gusanos N2 en 4 de 10 cm de alto crecimiento (HG) las placas hasta que la mayoría de los gusanos son adultas grávidas ^{de 18 años.} Lavar gusanos a un tubo cónico de 15 ml que contiene una solución 01:05 lejía alcalina y se incuba con la rotación hasta que los gusanos empiezan a disolverse, no más de 5 minutos ^9. Lave los gusanos tres veces con M9, desacelerándose a 1500 xg entre cada lavado sin frenos.
2. Placa blanqueados embriones sobre 8 150 mm y placas de NGM permitan desarrollar larvas L4 (aproximadamente 48 horas de Bristol N2 a 22 ° C).Mueva placas de cámaras ambientales y exponer a hipóxica (1.000 ppm, 5.000 ppm) y anóxicas (N2) condiciones durante 4 horas. Los tiempos de exposición variará dependiendo del diseño experimental. Mientras que la exposición a la hipoxia tiene un efecto inmediato sobre la tasa de puesta de huevos, embriones de dos células mueren después de 16-18 horas de la exposición ^12. Con esta configuración cámara hipoxia, el límite inferior de la exposición se ve limitada por el tipo de cambio atmósfera necesaria para alcanzar el equilibrio.
3. Etiqueta de un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml y un tubo de 15 ml cónico para cada muestra experimental. Los gusanos expuestos a la hipoxia son más propensas a pegarse a las paredes del tubo durante la cosecha. Para evitar esto, el lugar 100 l de sulfato de sodio al 1% de dodecil (SDS) en cada tubo cónico de 15 ml. Si SDS inhibe aplicaciones posteriores, albúmina de suero bovino (BSA) se puede utilizar para evitar que se pegue. El uso rutinario de la SDS o BSA no parecen tener una diferencia evidente. Añadir 50 l de 2x proteína carga colorante (4% de SDS, 10% de 2-mercaptoetanol y unrastrear de azul de bromofenol en 30% de glicerol (w / v)) para el tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Tener un Dewar de nitrógeno líquido listo.
4. El tiempo de los pasos después de la eliminación de los gusanos de la hipoxia y el registro. Retire la tapa de la cámara de hipoxia, tomar un plato de muestras, y cerrar la cámara. Use agua destilada para lavar los gusanos a un filtro de nylon y luego verter en el tubo cónico de 15 ml. Haga girar los gusanos en una centrífuga de sobremesa a 1500 xg durante 15-20 segundos con freno.
5. Utilizar un vacío para eliminar la mayor parte del sobrenadante del tubo, dejando intacto el gusano de pellets.
6. Con una pipeta, mover el gusano de pellet en 50 l del tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Cierre el tubo y se sumergen en nitrógeno líquido.
7. Repita hasta que todas las muestras han sido aislados. Siga estos procedimientos para las muestras de control de aire de la casa de la coherencia. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C.

6. Los resultados representativos

Organismal efectos de la hipoxia puede versemediante el examen de la viabilidad a la edad adulta de C. elegans (Figura 2). Los embriones puestos por tipo salvaje Bristol (N2) y HIF-1 (ia04) mutantes de deleción son todos sobreviven en la casa de aire _{concentraciones} de O2 (210.000 ppm de O _2). N ₂ los gusanos son capaces de adaptarse y sobrevivir a la edad adulta en ppm S 5000 _2, mientras que HIF-1 embriones no son viables. Esto demuestra que HIF-1 es esencial para la adaptación a los niveles cambiantes de oxígeno disponible en el entorno ^10. Ni N2, ni animales de HIF-1 puede sobrevivir a la exposición a 1.000 ppm de O _2.

Visualización de gusano directamente en la hipoxia es factible con el uso de un microscopio de disección y recipiente transparente (Figura 3). Al colocar directamente la cámara de hipoxia en el microscopio de disección, no hay necesidad de eliminar los gusanos de la hipoxia para observar las reacciones de organismos. El ámbito puede estar equipado con illumation fluorescencia (como en la Figura 3

Figura 1. Ejemplo de hipoxia cámara. La dirección del flujo de gas se indica por las flechas. El gas se almacena en los tanques de gas comprimido con definidos O ₂ concentraciones (1) y un regulador de dos etapas se adjunta (2). El gas entra la parte inferior del tubo de flujo (3), que sale de la parte superior a la tasa de flujo correcto. El gas fluye en el matraz de burbuja (4), la hidratación del gas (asegurar la correcta conexión de burbuja matraz mediante la observación de burbujas). Gas hidratado luego pasa a la cámara de hipoxia en la válvula de entrada (5), exponiendo las muestras a la hipoxia. El gas, finalmente, los respiraderos en la habitación a través de un orificio de escape perforado en la cámara.

Figura 2. La viabilidad de los embriones expuestos a 1000 ppm de O _2, 5000 ppm de O _2). Los embriones fueron expuestos a las condiciones de cada uno de oxígeno como embriones de 24 horas continuas en cámaras de flujo de oxígeno. Los gusanos fueron trasladados a normoxic condiciones, permitieron el desarrollo hasta la edad adulta durante 48 horas, y luego anotó para la viabilidad a la edad adulta. n> 50, N = 5.

Figura 3. Visualización de C. elegans en la hipoxia con el microscopio. Los gusanos están expuestos a la hipoxia utilizando los métodos descritos. La cámara transparente ambiental (construido con una placa de cristalización Pyrex y la placa de vidrio) se coloca directamente en la etapa de un microscopio de disección. Dos puntos de vista se muestran, uno que incluye el flujo de gas de todo el conjunto, los otros sólo con la cámara sobre la platina del microscopio.

Discusión

Este método presenta una estrategia para construir un entorno hipóxico que permite ambientes con concentraciones exactas de oxígeno para ser mantenidas en el laboratorio. Estas cámaras proporcionan un método sencillo para exponer a los organismos específicos bajas concentraciones de O ₂ y el seguimiento de las salidas moleculares y fisiológicas. La cámara ambiental descrito es montado por el laboratorio en lugar de comercialmente adquirida y por lo tanto puede ser modificado para adaptarse a las necesidades d...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
Tubería (FEP y PTFE)	Cole Parmer Tygon	YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) 'R-3603
Accesorios de compresión	Seattle Fluid Systems	06.363-58 (M. acoplador de 1/16 ") 06363-62 (F. acoplador de 1/16 ") 06363-60 (M. acoplador 1/8 ") 06363-61 (F. acoplador 1/8 ")
Flujo de tubo	Aalborg	PMR3-010073 (3 de salida) PMR1-013520 (1 salida)
Misa controlador de flujo	Sierra Instruments	810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Misa Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2)
Tanque de gas comprimido	Airgas	Hecho por encargo
Luer macho de plástico a los accesorios para manguera	Cole Parmer	45.505-41 (serie 500 1/16 ")
Reparto de cajas de acrílico	Ellard Instrumentación	Hecho por encargo
Accesorios de tubería (de latón o acero inoxidable)	Seattle Fluid Systems	B-402-1 (1/4 "tuerca) B-200-3 (1/8 "camiseta de la Unión) B-400-conjunto (1/4 "casquillos) B-QM2-B1-200 (control de calidad QM Cuerpo) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "macho conn)
Dow Corning grasa de vacío	Sigma-Aldrich	Z273554
AnaeroPack cuadro	Misubishi Gas Chemical Company	R684004 (0,4 litros) R685025 (2,5 litros) R685070 (7,0 litros)
Pyrex de gas botella de lavado	Sigma-Aldrich	CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml)
El ácido palmítico	Sigma-Aldrich	P0500
De cabra anti-IgG de ratón-peroxidasa de rábano	Southern Biotechnology Asociados	1032-1005
SuperSignal West Pico Chemiluminsecent sustrato	Pierce Chemical	34077
100 x 50 platos de cristal de la cristalización	Kimax Kimble	23000