Este documento detalla cómo usar cámaras de flujo continuo de hipoxia para generar atmósferas con concentraciones definidas de O 2 Entender las respuestas biológicas a la disminución de O 2. Este sistema es fácil de instalar y mantener, y lo suficientemente flexible como para adaptarse a una amplia gama de O 2 Concentraciones y sistemas modelo
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Artículo de método
Creación de ambientes definidos de gases para el Estudio de los efectos de la hipoxia en el
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Resumen
Resumen
El oxígeno es esencial para todos los metazoos para sobrevivir, con una sola excepción conocida 1. Disminución de la disponibilidad de O 2 (hipoxia) pueden surgir durante los estados de la enfermedad, el desarrollo normal o cambios en las condiciones ambientales 2-5. La comprensión de las vías de señalización celular que están implicadas en la respuesta a la hipoxia podría proporcionar una nueva visión de las estrategias de tratamiento para diversas patologías humanas, los accidentes cerebrovasculares hasta el cáncer. Este objetivo se ha visto obstaculizada, al menos en parte, por las dificultades técnicas asociadas a la exposición controlada de hipoxia en los organismos genéticamente susceptibles modelo.
Los nematodo Caenorhabditis elegans es ideal como un organismo modelo para el estudio de respuesta hipóxica, ya que es fácil de manipular genéticamente y la cultura. Además, es posible estudiar la respuesta celular a hipoxia específicas de O 2 concentraciones sin efectos de confusión desde C. elegans obtención de O 2 (y otros gases) por difusión, en oposición a un sistema respiratorio facilitado 6. Factores que se sabe están implicados en la respuesta a la hipoxia se conservan en C. elegans. La respuesta real a la hipoxia depende de la concentración específica de O 2 que está disponible. En C. elegans, la exposición a la hipoxia moderada provoca una respuesta transcripcional mediada en gran parte por HIF-1, los altamente conservadas por la hipoxia-inducible factor de transcripción 6-9. C. elegans embriones requieren HIF-1 para sobrevivir en 5,000-20,000 ppm de O 2 7,10 . La hipoxia es un término general para "menos de lo normal de O 2". Normoxia (normal O 2) también puede ser difícil de definir. En general, consideramos aire de la habitación, que es 210.000 ppm de O 2 para ser normoxia. Sin embargo, se ha demostrado que C. elegans tiene una preferencia conductual para el O 2 concentraciones de 5.12% (50.000-120.000 ppm O 2) 11. En larvae y adultos, HIF-1 actúa para prevenir la hipoxia inducida por la diapausa en 5000 ppm de O 2 12. Sin embargo, HIF-1 no juega un papel en la respuesta a bajas concentraciones de O 2 (anoxia, la definición operativa <10 ppm de O 2) 13. En la anoxia, C. elegans entra en un estado de animación suspendida reversible en el que toda la actividad observable al microscopio deja 10. El hecho de que diferentes respuestas fisiológicas se producen en diferentes condiciones destaca la importancia de tener control experimental sobre la concentración de O 2 hipóxico.
A continuación, presentamos un método para la construcción e implementación de cámaras ambientales que producen condiciones de hipoxia confiables y reproducibles, con concentraciones definidas de O 2. El método de flujo continuo asegura un rápido equilibrio de la cámara y aumenta la estabilidad del sistema. Además, la transparencia yaccesibilidad de las cámaras permiten la visualización directa de los animales estén expuestos a la hipoxia. Además, demuestran un método eficaz de recolección C. elegans muestras rápidamente después de la exposición a la hipoxia, que es necesario observar muchos de los cambios rápidamente-invertidos que se producen en la hipoxia 10,14. Este método proporciona un fundamento básico que puede ser fácilmente modificado para las necesidades de cada laboratorio, incluidos los sistemas de modelos diferentes y una variedad de gases.
Protocolo
1. Construcción de cámaras de medio ambiente
- Seleccione el tamaño de volumen razonable de la cámara necesarios para el alcance de su proyecto. Cámara debe estar hecha de gas (O 2) material impermeable. Platos Pyrex cristalización, cajas Anaeropack o grandes acrílico fundido cajas (Ellard Instrumentación), se pueden utilizar. Hemos encontrado que 9 mm placas 50 puede encajar en un 100 x 50 placa de cristalización Kimex. Las placas de vidrio se puede utilizar como tapas para platos de cristalización Pyrex.
- Haga un agujero en la cámara seleccionada y se ajustan con un macho de plástico Luer de conexión de la manguera púa (Cole Parmer). Ac....
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Discusión
Este método presenta una estrategia para construir un entorno hipóxico que permite ambientes con concentraciones exactas de oxígeno para ser mantenidas en el laboratorio. Estas cámaras proporcionan un método sencillo para exponer a los organismos específicos bajas concentraciones de O 2 y el seguimiento de las salidas moleculares y fisiológicas. La cámara ambiental descrito es montado por el laboratorio en lugar de comercialmente adquirida y por lo tanto puede ser modificado para adaptarse a las necesidades d.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Damos las gracias a los miembros del laboratorio de Miller para la discusión y lectura crítica del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un premio nuevo investigador del Centro de Choque Nathan de Excelencia en la biología básica de vejez para DLM y los Institutos Nacionales de Salud de adjudicación del R00 AG030550 de DLM.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | |
| Tubería (FEP y PTFE) | Cole Parmer Tygon | YO-95821-00 (1/8 "FEP) 06605-27 (1/16 x 1/8 "PTFE) 'R-3603 | |
| Accesorios de compresión | Seattle Fluid Systems | 06.363-58 (M. acoplador de 1/16 ") 06363-62 (F. acoplador de 1/16 ") 06363-60 (M. acoplador 1/8 ") 06363-61 (F. acoplador 1/8 ") | |
| Flujo de tubo | Aalborg | PMR3-010073 (3 de salida) PMR1-013520 (1 salida) | |
| Misa controlador de flujo | Sierra Instruments | 810S-L-DR-2-OV1-SK1-V1-S1 (Misa Trak) C100L-DD-2-OV1-SV1-PV2-V1-SO-C10 (Smart Trak 2) | |
| Tanque de gas comprimido | Airgas | Hecho por encargo | |
| Luer macho de plástico a los accesorios para manguera | Cole Parmer | 45.505-41 (serie 500 1/16 ") | |
| Reparto de cajas de acrílico | Ellard Instrumentación | Hecho por encargo | |
| Accesorios de tubería (de latón o acero inoxidable) | Seattle Fluid Systems | B-402-1 (1/4 "tuerca) B-200-3 (1/8 "camiseta de la Unión) B-400-conjunto (1/4 "casquillos) B-QM2-B1-200 (control de calidad QM Cuerpo) B-200-1-2 (1/8 x 1/8 "macho conn) | |
| Dow Corning grasa de vacío | Sigma-Aldrich | Z273554 | |
| AnaeroPack cuadro | Misubishi Gas Chemical Company | R684004 (0,4 litros) R685025 (2,5 litros) R685070 (7,0 litros) | |
| Pyrex de gas botella de lavado | Sigma-Aldrich | CLS31770500C (500 ml) CLS31770250C (250 ml) CLS31770125C (125 ml) | |
| El ácido palmítico | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| De cabra anti-IgG de ratón-peroxidasa de rábano | Southern Biotechnology Asociados | 1032-1005 | |
| SuperSignal West Pico Chemiluminsecent sustrato | Pierce Chemical | 34077 | |
| 100 x 50 platos de cristal de la cristalización | Kimax Kimble | 23000 |
Referencias
- Danovaro, R. The first metazoa living in permanently anoxic conditions. BMC Biology. 8, 30(2010).
- Birner, P. Overexpression of Hypoxia-inducible Factor 1 alpha Is a Marker for an Unfavorable Prognosis in Early-Stage Invasive Ce....
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Reimpresiones y permisos
