Artículo de método

C. elegans Seguimiento y Medición del Comportamiento

DOI:

10.3791/4094

⸱

17 de noviembre de 2012

 ,  ,  , 
1Donnelly Centre, University of Toronto, 2Department of Physics and Astronomy, Vrije Universiteit, 3Okinawa Institute of Science and Technology, 4Department of Physics, University of Toronto

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos desarrollado un sistema de seguimiento de vídeo de tasa microscopio que puede registrar y cuantificar C. elegans Comportamiento a alta resolución y alta velocidad. También se han desarrollado métodos computacionales para reducir la dimensionalidad de las imágenes de gusano a un conjunto fundamental de mediciones que describen completamente la forma del gusano.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hemos desarrollado técnicas de instrumentación, procesamiento de imágenes, y los datos de análisis para cuantificar el comportamiento locomotor de C. elegans como se arrastra sobre la superficie de una placa de agar. Para el estudio de la base genética, bioquímica, y neuronal de la conducta, C. elegans es un organismo ideal, ya que es genéticamente tratable, susceptible de microscopía, y muestra una serie de comportamientos complejos, incluidos los taxis, el aprendizaje y la interacción social 1,2. El análisis del comportamiento basado en el seguimiento de los movimientos de los gusanos que se arrastran sobre placas de agar han sido particularmente útiles en el estudio del comportamiento sensorial 3, 4 locomoción, y fenotipificación generales mutacional 5. Nuestro sistema funciona moviendo el sistema de cámara e iluminación como los gusanos se arrastra en una placa de agar estacionaria, que asegura que no se estímulo mecánico se transmite al gusano. Nuestro sistema de seguimiento es fácil de usar e incluye una función de calibración semi-automática. Un challenge de todos los sistemas de vídeo de seguimiento es que genera una enorme cantidad de datos que es intrínsecamente alta dimensional. Nuestro procesamiento de imágenes y programas de análisis de datos de resolver este problema mediante la reducción de la forma de gusanos en un conjunto de componentes independientes, que comprensiblemente reconstruir el comportamiento gusanos como una función de solamente dimensiones 3-4 6,7. Como un ejemplo del proceso se muestra que el gusano entra y sale de su estado de revocación de una manera específica de fase.

Protocolo

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1. Descripción de Microscopio de seguimiento

  1. Una placa de agar es iluminado por una fuente de luz de fibra y con imágenes de una cámara. Este sistema está montado en una X, Y etapa de traducción.
  2. La etapa se desplaza por estándar de motores paso a paso, que están conectados a un controlador de motor paso a paso.
  3. El controlador y la cámara están conectados al ordenador y controlados por programas personalizados escritos en LabVIEW.
  4. La cámara de las imágenes de la superficie de una placa de agar e identifica objetos oscuros sobre un fondo claro.
  5. La calidad de la imagen se ajusta de modo que el programa de ordenador puede cuantificar objetos en tiempo real. La ganancia, el brillo y la velocidad del obturador de la cámara se puede ajustar para proporcionar un objeto oscuro sobre un fondo blanco.
  6. Una marca de calibración para la calibración automática se realiza por meter la superficie de agar con un pico gusano.
  7. La imagen filtrada, binario que es utilizado por el programa de seguimiento puede ser comprobado.
  8. El modoftware tiene una función de auto-calibración que calcula la matriz de calibración moviendo un objeto de prueba a una distancia fija.
  9. Las distancias en píxeles está calibrado a los pasos dados por el motor paso a paso por la matriz de calibración.
  10. Después de la calibración, el sistema está listo para funcionar y no es necesario volver a calibrar a menos que el aumento se cambia o si la cámara está reposicionado.

2. Preparación de las placas de Seguimiento y C. elegans para el rastreo

  1. Un anillo de cobre se usa para acorralar los gusanos y evitar que la migración hasta el borde de la placa. El cobre proporciona una barrera química local, y no afecta el movimiento del gusano de otro modo para la duración del experimento (<1 h). Calentar el anillo primero colocándolo en un bloque de calor o equivalente.
  2. Colocar el anillo sobre una placa de agar fresco (1,7% de agar Bacto, 0,25% de Bacto-peptona, 0,3% de NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM de tampón de fosfato de potasio, 5 g / mlcolesterol) y presione ligeramente para incrustarlo en la superficie del agar.
  3. Elige L4 etapa o gusanos adultos jóvenes en una placa de agar lleno de algún buffer de NGM (0,3% NaCl, 1 mM CaCl 2, 1 mM MgSO 4, 25 mM tampón fosfato de potasio) para lavarlos de residuos de comida. Deje que los gusanos nadar durante unos minutos.
  4. Cuidadosamente coloque un solo gusano sobre la placa de seguimiento de cerca del centro del anillo. Y a continuación, coloque la placa sobre el seguimiento de gusano.

3. Gusano de seguimiento

  1. Ejecute el programa LabVIEW y seleccione las opciones si es necesario (la ubicación de las imágenes, los tipos de imágenes, mediciones, ajustes de la cámara).
  2. Uso de la palanca de mando mover el microscopio hasta que una imagen de el gusano está en el campo de visión (pantalla de ordenador). Pulse el botón "pista" para activar el programa de seguimiento.
  3. El programa de ordenador en realidad mide los movimientos de un imágenes binarias filtradas tal como se muestra y puede hacer mediciones en esta imagen en tiempo real
  4. En popaer el seguimiento de una reconstrucción de la trayectoria global puede hacerse a partir de los movimientos de motor paso a paso, mientras que los cambios en la forma locales del gusano se puede ver en detalle.

4. Análisis de Datos

  1. Ejecutar script skeletonizing (MATLAB) para parametrizar las formas del gusano. (Figura 2)
  2. Cálculo de los modos propios de los datos esqueletizados. (Figura 3,4)
  3. Mostrar la Figura 5. Lea leyenda de la figura o resultados representativos.

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Resultados

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Ejemplo: Al forrajear, C. elegans transiciones de marcha adelante a marcha atrás, a menudo realizando una reorientación (giro omega) antes de volver al estado de movimiento hacia adelante. La cuantificación de esta transición es importante para entender los patrones de alimentación de los movimientos y también en el control motor del gusano. El poder para revelar los detalles sutiles de comportamiento locomoción puede ser visto usando nuestro dispositivo rastreador.

Como ejemplo, po...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El estudio de la locomoción y el comportamiento natural requiere técnicas no invasivas de seguimiento en pareja con las técnicas de reducción de datos. Aquí hemos demostrado un fácil utilizar el sistema de rastreo que registra imágenes detalladas de C. elegans comportamiento, ya que se arrastra sobre la superficie de una placa de agar. La cantidad de información contenida en estas imágenes es muy amplio y alto-dimensional, por lo que también han desarrollado métodos para reducir la dimensionalidad de los datos ...

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre de la parte Empresa Número de catálogo Comentarios (opcional)
CCD cámara Basler A601f
Lente Edmund Optics MMS serie
Fibra de iluminación Dolan Jenner DC-950H
Traducción etapa Deltron LS3-4
Motor paso a paso EE.UU. digitales MS23C
Stepper motor de accionamiento Geco G201
Control de motor paso a paso SimpleStep SSXYZ
Todo el código de programación está disponible. Por favor, envíe un correo electrónico a petición del autor correspondiente.

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenner, S. The genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77 (1), 71-79 (1974).
  2. de Bono, M., Maricq, A. V. Neuronal substrates of complex behaviors in C. elegans. Annu. Rev. Neurosci. (28), 451-501 (2005).
  3. Pierce-Shimomura, J. T., Morse, T. M., Lockery, S. R. The fundamental role of pirouettes in Caenorhabditis elegans chemotaxis. J. Neurosci. 19 (21), 9557-9569 (1999).
  4. Gray, J. M., Hill, J. J., Bargmann, C. I. A circuit for navigation in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (9), 3184-3191 (2005).
  5. Baek, J. H., Cosman, P., Feng, Z., Silver, J., Schafer, W. R. Using machine vision to analyze and classify Caenorhabditis elegans behavioral phenotypes quantitatively. J. Neurosci. Methods. 118 (1), 9-21 (2002).
  6. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. Dimensionality and Dynamics in the Behavior of C. elegans. PLoS Comput. Biol. 4 (1), e1000028(2008).
  7. Stephens, G. J., Johnson-Kerner, B., Bialek, W., Ryu, W. S. From modes to movement in the behavior of C. elegans. PLoS One. 5 (11), e13914(2010).
  8. Feng, Z., Cronin, C. J., Wittig, J. H. Jr, Sternberg, P. W., Schafer, W. R. An imaging system for standardized quantitative analysis of C. elegans behavior. BMC Bioinformatics. (5), 115(2004).
  9. Ramot, D., Johnson, B. E., Berry, T. L. Jr, Carnell, L., Goodman, M. B. The Parallel Worm Tracker: A Platform for Measuring Average Speed and Drug-Induced Paralysis in Nematodes. PLoS One. 3 (5), e2208(2008).
  10. Swierczek, N. A., Giles, A. C., Rankin, C. H., Kerr, R. A. High-throughput behavioral analysis in C. elegans. Nat. Methods. 8 (7), 592-598 (2011).
  11. Leifer, A. M., Fang-Yen, C., Gershow, M., Alkema, M. J., Samuel, A. D. Optogenetic manipulation of neural activity in freely moving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 147-152 (2011).
  12. Stirman, J. N., Crane, M. M., Husson, S. J., Wabnig, S., Schultheis, C., Gottschalk, A., Lu, H. Real-time multimodal optical control of neurons and muscles in freely behaving Caenorhabditis elegans. Nat. Methods. 8 (2), 153-158 (2011).
  13. Ben Arous, J., Tanizawa, Y., Rabinowitch, I., Chatenay, D., Schafer, W. R. Automated imaging of neuronal activity in freely behaving Caenorhabditis elegans. J Neurosci Methods. 187 (2), 229-234 (2010).
  14. Wittenburg, N., Baumeister, R. Thermal avoidance in Caenorhabditis elegans: an approach to the study of nociception. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96 (18), 10477-10482 (1999).

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