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Los métodos de encapsulación microfluídica se han utilizado previamente para capturar células en gotas acuosas monodispersas a escala de picolitros, proporcionando confinamiento desde un entorno de fluido a granel con aplicaciones en cribado de alto rendimiento, citometría y espectrometría de masas. Describimos un método no solo para encapsular células individuales, sino para capturar repetidamente un número determinado de células (aquí demostramos la encapsulación de una y dos células) para estudiar tanto el aislamiento como las interacciones entre células en grupos de tamaños controlados. Al combinar técnicas de generación de gotas con el ordenamiento de celdas y partículas, demostramos la encapsulación controlada de partículas del tamaño de una celda para una encapsulación eficiente y continua. Utilizando una suspensión acuosa de partículas y aceite de fluorocarbono inmiscible, generamos gotas acuosas en aceite con una boquilla de enfoque de flujo. El caudal acuoso es lo suficientemente alto como para crear un ordenamiento de las partículas que llegan a la boquilla a múltiples frecuencias enteras de la frecuencia de generación de gotas, encapsulando un número controlado de celdas en cada gota. Para obtener resultados representativos, se utilizan partículas de poliestireno de 9,9 μm como sustitutos celulares. Este estudio muestra una eficiencia de encapsulación de una sola partícula Pk=1 del 83,7% y una eficiencia de encapsulación de doble partícula Pk=2 del 79,5% en comparación con sus respectivas eficiencias de Poisson del 39,3% y 33,3%, respectivamente. Se ha demostrado que el efecto de una concentración constante de células y partículas es de gran importancia para una encapsulación eficiente, y también se abordan las transiciones de goteo a chorro.
Introducción
Las suspensiones celulares acuosas de medios continuos comparten un entorno fluido común que permite que las células interactúen en paralelo y también homogeneiza los efectos de células específicas en las mediciones del medio. La encapsulación de alto rendimiento de las células en gotas a escala de picolitros confina las muestras para proteger las gotas de la contaminación cruzada, permite medir la diversidad celular dentro de las muestras, evita la dilución de los reactivos y los biomarcadores expresados, y amplifica las señales de los productos del biorreactor. Las gotas también brindan la capacidad de volver a fusionar gotas en muestras acuosas más grandes o con otras gotas para estudios de señalización intercelular. 1,2 La reducción de la dilución implica señales de detección más fuertes para mediciones de mayor precisión, así como la capacidad de reducir los volúmenes de muestras y reactivos potencialmente costosos. 3 La encapsulación de células en gotas se ha utilizado para mejorar la detección de la expresión de proteínas,4 anticuerpos,5,6 enzimas,7 y la actividad metabólica8 para el cribado de alto rendimiento, y podría utilizarse para mejorar la citometría de alto rendimiento. 9 Estudios adicionales presentan aplicaciones en bio-electrospray de gotas que contienen celdas para espectrometría de masas10 y recubrimientos de celdas de superficie dirigidas. 11 Algunas aplicaciones, sin embargo, se han visto limitadas por la falta de capacidad para controlar el número de células encapsuladas en gotas. Aquí presentamos un método de encapsulación ordenada12 que aumenta las eficiencias de encapsulación demostradas para una y dos celdas y puede extrapolarse para la encapsulación de un mayor número de celdas.
Para lograr la generación de gotas monodispersas, el "enfoque de flujo" microfluídico permite la creación de gotas de tamaño controlable de un fluido (una mezcla de celdas acuosas) dentro de otro (una fase de aceite continuo) mediante el uso de una boquilla en la que convergen las corrientes. 13 Para una geometría de boquilla dada, la frecuencia de generación de gotas f y el tamaño de la gota se pueden modificar ajustando los caudales de aceite y acuosos Qoil y Qaq. A medida que aumentan los caudales, los flujos pueden pasar de la generación de gotas a la inyección inestable de fluido acuoso desde la boquilla. 14
Cuando la solución acuosa contiene partículas en suspensión, las partículas se encapsulan y se aíslan unas de otras en la boquilla. Para la generación de gotas utilizando una suspensión de células acuosas distribuidas aleatoriamente, la fracción media de gotas Dk que contienen k células está dictada por el estadístico de Poisson, donde Dk = λk exp(-λ)/(k!) y λ es el número medio de células por gota. La fracción de celdas que terminan en las gotas encapsuladas "correctamente" se calcula usando Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). La diferencia sutil entre las dos métricas es que Dk se relaciona con la utilización de fluido acuoso y la cantidad de clasificación de gotas que debe completarse después de la encapsulación, y Pk se relaciona con la utilización de la muestra de celda. Por ejemplo, se podría usar una suspensión celular diluida (λ baja) para encapsular gotas donde la mayoría de las gotas que contienen células contendrían solo una célula. Mientras que la métrica de eficiencia Pk sería alta, la mayoría de las gotas estarían vacías (Dk bajo), lo que requeriría un mecanismo de clasificación para eliminar las gotas vacías, lo que también reduciría el rendimiento. 15
La combinación de la generación de gotas con el orden inercial proporciona la capacidad de encapsular gotas con un número más predecible de celdas por gota y mayores rendimientos que la encapsulación aleatoria. El enfoque inercial fue descubierto por primera vez por Segre y Silberberg16 y se refiere a la tendencia de las partículas de tamaño finito a migrar a posiciones de equilibrio lateral en el flujo del canal. El ordenamiento inercial se refiere a la tendencia de las partículas y células a organizarse pasivamente en trenes de velocidad constante, escalonados e igualmente espaciados. Tanto el enfoque como el pedido requieren caudales suficientemente altos (número de Reynolds alto) y tamaños de partícula (número de Reynolds de partícula alto). 17,18 Aquí, el número de Reynolds Re = uDh / ν y la partícula Número de Reynolds Rep = Re(a / Dh)2, donde u es una velocidad de flujo característica, Dh [= 2wh / (w + h)] es el diámetro hidráulico, ν es la viscosidad cinemática, a es el diámetro de la partícula, w es el ancho del canal y h es la altura del canal. Empíricamente, la longitud requerida para lograr trenes completamente ordenados disminuye a medida que Re y Rep aumentan. Tenga en cuenta que los altos requisitos de Re y Rep (para este estudio del orden de 5 y 0,5, respectivamente) pueden entrar en conflicto con la necesidad de mantener bajos los caudales acuosos para evitar chorros en la boquilla de generación de gotas. Además, los altos caudales conducen a mayores tensiones de cizallamiento en las celdas, que no se abordan en este protocolo. El estudio de encapsulación ordenada anterior demostró que más del 90% de las células HL60 encapsuladas individualmente en condiciones de flujo similares a las de este estudio mantuvieron la integridad de la membrana celular. 12 Sin embargo, el efecto de la magnitud y las escalas de tiempo de los esfuerzos cortantes deberá considerarse cuidadosamente al extrapolar a diferentes tipos de celdas y parámetros de flujo. La superposición de las restricciones de caudal acuoso de la ordenación de las celdas, la generación de gotas y la viabilidad de las celdas proporciona un régimen operativo ideal para la encapsulación controlada de celdas simples y múltiples.
Debido a que muy pocos estudios abordan el espaciamiento entre trenes,19,20 determinar el espaciamiento se realiza más fácilmente empíricamente y dependerá de la geometría del canal, el caudal, el tamaño de partícula y la concentración de partículas. No obstante, el espaciado lateral igual entre los trenes implica que las celdas llegan a intervalos de tiempo predecibles y consistentes. Cuando la generación de gotas se produce a la misma velocidad a la que las células ordenadas llegan a la boquilla, las células se encapsulan dentro de la gota de forma controlada. Esta técnica se ha utilizado para encapsular células individuales con rendimientos del orden de 15 kHz,12 una mejora significativa con respecto a estudios anteriores que informan tasas de encapsulación del orden de 60-160 Hz.4,15 En el trabajo de encapsulación controlada, más del 80% de las gotas contenían una y solo una celda, una mejora significativa de la eficiencia con respecto a las estadísticas de Poisson (aleatorias), lo que predice menos del 40% de eficiencia en promedio. 12
En el trabajo previo de encapsulación controlada,12 el número promedio de partículas por gota λ se ajustó para proporcionar encapsulación de una sola célula. Nuestra hipótesis es que a través del ajuste de las tasas de flujo, podemos encapsular de manera eficiente cualquier número de celdas por gota cuando λ es igual o cercano al número deseado de celdas por gota. Mientras que la encapsulación de una sola célula es valiosa para determinar las respuestas de las células individuales a los estímulos, la encapsulación de múltiples células proporciona información relacionada con la interacción de números y tipos controlados de células. Aquí presentamos un protocolo, resultados representativos utilizando microesferas de poliestireno y una discusión para la encapsulación controlada de múltiples celdas utilizando un canal de ordenamiento inercial pasivo y una boquilla de generación de gotas.