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Artículo de método

De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

18K visualizaciones

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DOI:

10.3791/4096

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15 de junio de 2012

 , 
1Department of Mechanical Engineering, Vanderbilt University

En este artículo

Resumen

La combinación de generación monodispersas gota con ordenamiento inercial de células y partículas, se describe un método para encapsular un número deseado de células o partículas en una sola gota a tasas kHz. Se demuestra la eficiencia de dos veces superiores a las de la encapsulación no ordenada de las gotas de una y dos partículas.

Resumen

Los métodos de encapsulación microfluídica se han utilizado previamente para capturar células en gotas acuosas monodispersas a escala de picolitros, proporcionando un confinamiento a partir de un entorno de fluido masivo con aplicaciones en cribado de alto rendimiento, citometría y espectrometría de masas. Describimos un método para no solo encapsular células individuales, sino también capturar repetidamente un número determinado de células (aquí demostramos la encapsulación de una y dos células) con el fin de estudiar tanto el aislamiento como las interacciones entre células en grupos de tamaños controlados. Al combinar técnicas de generación de gotas con el ordenamiento de células y partículas, demostramos la encapsulación controlada de partículas del tamaño de células para una encapsulación eficiente y continua. Utilizando una suspensión acuosa de partículas y aceite inmiscible de fluorocarbono, generamos gotas acuosas en aceite mediante una boquilla de enfoque por flujo. La velocidad de flujo acuoso es suficientemente alta como para crear un ordenamiento de partículas que llegan a la boquilla a frecuencias múltiplos enteros de la frecuencia de generación de gotas, encapsulando un número controlado de células en cada gota. Como resultados representativos, se utilizan partículas de poliestireno de 9,9 μm como sustitutos celulares. Este estudio muestra una eficiencia de encapsulación de una sola partícula Pk=1 del 83,7 % y una eficiencia de encapsulación de dos partículas Pk=2 del 79,5 %, en comparación con sus eficiencias de Poisson respectivas del 39,3 % y el 33,3 %. Se demuestra que la concentración constante de células y partículas es de gran importancia para una encapsulación eficiente, y también se abordan las transiciones de goteo a chorro.

Introducción

Las suspensiones celulares acuosas en medio continuo comparten un entorno fluido común que permite a las células interactuar en paralelo y también homogeniza los efectos de células específicas en las mediciones del medio. La encapsulación de alto rendimiento de células en gotas a escala de picolitros confina las muestras para protegerlas de la contaminación cruzada, permite medir la diversidad celular dentro de las muestras, evita la dilución de reactivos y biomarcadores expresados, y amplifica las señales provenientes de los productos del biorreactor. Las gotas también ofrecen la posibilidad de volver a fusionarlas en muestras acuosas más grandes o con otras gotas para estudios de señalización intercelular.1,2 La reducción de la dilución implica señales de detección más fuertes para mediciones con mayor precisión, así como la posibilidad de reducir volúmenes de muestras y reactivos que podrían ser costosos.3 La encapsulación de células en gotas se ha utilizado para mejorar la detección de expresión proteica,4 anticuerpos,5,6 enzimas,7 y actividad metabólica8 en cribados de alto rendimiento, y podría emplearse para mejorar la citometría de alto rendimiento.9 Otros estudios presentan aplicaciones en bioelectrospray de gotas que contienen células para espectrometría de masas10 y recubrimientos celulares superficiales dirigidos.11 Sin embargo, algunas aplicaciones han estado limitadas por la falta de capacidad para controlar el número de células encapsuladas en las gotas. Aquí presentamos un método de encapsulación ordenada12 que aumenta las eficiencias de encapsulación demostradas para una y dos células y que podría extrapolarse para la encapsulación de un número mayor de células.

Para lograr la generación de gotas monodispersas, el método microfluídico de «enfoque de flujo» permite crear gotas de tamaño controlable de un fluido (una mezcla acuosa de células) dentro de otro (una fase continua de aceite) mediante una boquilla en la que confluyen las corrientes.13 Para una geometría determinada de boquilla, la frecuencia de generación de gotas f y el tamaño de las gotas pueden modificarse ajustando los caudales de aceite y de la fase acuosa Qoil y Qaq. A medida que aumentan los caudales, los flujos pueden pasar de la generación de gotas a la emisión inestable en forma de chorro del fluido acuoso desde la boquilla.14

Cuando la solución acuosa contiene partículas en suspensión, las partículas quedan encapsuladas y aisladas entre sí en la boquilla. Para la generación de gotas utilizando una suspensión celular acuosa distribuida aleatoriamente, la fracción promedio de gotas Dk que contienen k células está determinada por la estadística de Poisson, donde Dk = λk exp(-λ)/(k!) y λ es el número promedio de células por gota. La fracción de células que terminan en gotas encapsuladas "correctamente" se calcula usando Pk = (k x Dk)/Σ(k' x Dk'). La sutil diferencia entre estas dos métricas es que Dk se relaciona con el aprovechamiento del fluido acuoso y la cantidad de clasificación de gotas que debe realizarse tras el encapsulamiento, mientras que Pk se relaciona con el aprovechamiento de la muestra celular. Como ejemplo, se podría usar una suspensión celular diluida (λ bajo) para encapsular gotas en las que la mayoría de las gotas que contienen células tendrían solo una célula. Aunque la métrica de eficiencia Pk sería alta, la mayoría de las gotas estarían vacías (bajo Dk), lo que requeriría un mecanismo de clasificación para eliminar las gotas vacías, reduciendo así también el rendimiento.15

Combinar la generación de gotas con el ordenamiento inercial permite encapsular gotas con números más predecibles de células por gota y mayores velocidades de procesamiento que el encapsulamiento aleatorio. El enfoque inercial fue descubierto por primera vez por Segre y Silberberg16 y se refiere a la tendencia de partículas de tamaño finito a migrar hacia posiciones laterales de equilibrio en un flujo de canal. El ordenamiento inercial se refiere a la tendencia de las partículas y células a organizarse pasivamente en trenes igualmente espaciados, escalonados y con velocidad constante. Tanto el enfoque como el ordenamiento requieren tasas de flujo suficientemente altas (alto número de Reynolds) y tamaños de partícula elevados (alto número de Reynolds de partícula)17,18. Aquí, el número de Reynolds Re =uDh/ν y el número de Reynolds de partícula Rep =Re(a/Dh)2, donde u es una velocidad característica del flujo, Dh [=2wh/(w+h)] es el diámetro hidráulico, ν es la viscosidad cinemática, a es el diámetro de la partícula, w es el ancho del canal y h es la altura del canal. Empíricamente, la longitud necesaria para lograr trenes completamente ordenados disminuye al aumentar Re y Rep. Obsérvese que los requisitos de altos valores de Re y Rep (en este estudio del orden de 5 y 0,5, respectivamente) pueden entrar en conflicto con la necesidad de mantener bajas las tasas de flujo acuoso para evitar la formación de chorros en la boquilla de generación de gotas. Además, altas tasas de flujo generan mayores esfuerzos cortantes sobre las células, aspecto que no se aborda en este protocolo. Un estudio previo sobre encapsulamiento ordenado demostró que más del 90 % de las células HL60 encapsuladas individualmente bajo condiciones de flujo similares a las de este estudio mantuvieron la integridad de la membrana celular12. Sin embargo, el efecto de la magnitud y las escalas temporales de los esfuerzos cortantes deberá considerarse cuidadosamente al extrapolar a diferentes tipos celulares y parámetros de flujo. La superposición de las restricciones relacionadas con el ordenamiento celular, la generación de gotas y la viabilidad celular en función de las tasas de flujo acuosas proporciona un régimen operativo ideal para el encapsulamiento controlado de células individuales y múltiples.

Debido a que muy pocos estudios abordan el espaciado entre trenes de partículas,19,20 la determinación de este espaciado se realiza más fácilmente de forma empírica y dependerá de la geometría del canal, la velocidad de flujo, el tamaño de las partículas y la concentración de partículas. No obstante, el espaciado lateral uniforme entre los trenes implica que las células llegan a intervalos de tiempo predecibles y constantes. Cuando la generación de gotas ocurre al mismo ritmo con el que las células ordenadas llegan a la boquilla, las células quedan encapsuladas dentro de las gotas de manera controlada. Esta técnica se ha utilizado para encapsular células individuales con rendimientos del orden de 15 kHz,12 una mejora significativa frente a estudios previos que informaron tasas de encapsulación del orden de 60-160 Hz.4,15 En el trabajo de encapsulación controlada, más del 80 % de las gotas contenían una y solo una célula, una mejora significativa en eficiencia frente a la estadística de Poisson (aleatoria), que predice una eficiencia inferior al 40 % en promedio.12

En trabajos anteriores sobre encapsulación controlada,12 el número promedio de partículas por gota λ se ajustó para lograr la encapsulación de una sola célula. Planteamos la hipótesis de que, mediante el ajuste de las tasas de flujo, podemos encapsular eficientemente cualquier número de células por gota cuando λ es igual o cercano al número deseado de células por gota. Si bien la encapsulación de una sola célula es útil para determinar las respuestas individuales de las células a estímulos, la encapsulación de múltiples células proporciona información relacionada con la interacción entre números y tipos controlados de células. Aquí presentamos un protocolo, resultados representativos utilizando microesferas de poliestireno y una discusión sobre la encapsulación controlada de múltiples células mediante un canal pasivo de ordenamiento inercial y una boquilla de generación de gotas.

Protocolo

Los protocolos de esta sección describen los materiales y equipos utilizados específicamente para obtener los resultados experimentales presentados. Tenga en cuenta que los proveedores alternativos para los productos químicos y equipos pueden ser utilizados.

1. Fabricación de los dispositivos y la litografía blanda

Las técnicas estándar de la litografía blanda, 21 algunos de los cuales se han presentado en los artículos anteriores JOVE, 22 se utilizaron para la creación de polidimetilsiloxano (PDMS) las redes de microcanales adheridos a sustratos de vidrio. Aparte de fabricación del molde maestro réplica por SU-8 fotolitografía, los procesos pueden llevarse a cabo fuera de una sala limpia o campana limpia, sin embargo, el polvo y las partículas aún debe ser minimizada para lograr resultados consistentes.

  1. Diseño de un patrón de micro-canal como se muestra en la Figura 1 en AutoCAD (Autodesk Inc.). Emplear a un fabricante de terceros (Fineline Imaging Inc.) para imprimir una alta resolución (50.000 ppp) transtransparencia en la máscara de la película de Mylar o de cuarzo, donde los canales son transparentes sobre un fondo oscuro.
  2. Crear un silicio y SU-8 amo fotosensible para el moldeo de réplica. Brevemente, girar SU-8 2050 (MicroChem) fotorresistencia negativa con rpm recomendado por el fabricante en un spin-revestidor para crear una capa de 52 micras de espesor sobre una superficie limpia de 7,5 cm o 10 cm de obleas de silicio. Después de hornear suave, con el borde la eliminación de cuentas, los rayos UV a través de una máscara de contacto, al horno después de la exposición, desarrollo y exposición a inundaciones, medir el espesor real de la capa de SU-8 mediante un perfilómetro Dektak (Veeco). Cinta del molde maestro en el fondo de un 4 "o 5" placa de Petri para preparar PDMS moldeo réplica.
  3. Mezcla PDMS base de elastómero con el agente de curado elastómero (Dow Corning) en una relación 10:1 w / w de base para el agente de curado. Verter bien mezclada precursor de PDMS en el patrón de silicio para crear una capa de 2-3 mm de espesor final. Una mezcla de 20 g de base de elastómero con 2 g de agente de curado es suficiente para cubrir un 4 "superficie diámetro.
  4. Coloque el master molde y PDMS en el desecador de vacío (Jencons) para des-gas no curado PDMS. El uso de un regulador de presión (Cole Parmer), lentamente disminuir la presión manométrica de 0 cámara "de Hg a -27" Hg durante 20 minutos para evitar la excesiva formación de espuma. Deje el dispositivo en la cámara de vacío a -27 "Hg durante 30 minutos o hasta que las burbujas de aire desaparezcan.
  5. De liberación de vacío y mover el molde maestro y PDMS a un horno de 65 ° C (Thermo Scientific) durante un mínimo de cuatro horas. El dispositivo se puede dejar en el horno durante la noche para mejorar el curado.
  6. Retire el dispositivo del horno y dejar enfriar. Corte cuidadosamente alrededor de la oblea PDMS circular usando un cuchillo de precisión y la cáscara de PDMS. Cortar contorno dispositivo como se muestra en la Figura 1 con un escalpelo.
  7. Ponche de fluidos puertos (tres por equipo) en las tres regiones circunvecinas se muestra en la Figura 1 con una biopsia por punción. Para este dispositivo, use un 0,75 mm de diámetro exterior de golpe (Harris).
  8. Adherirse cinta adhesiva al lado del patrón y la cáscara de PDMS para eliminar cualquierpolvo. Como una alternativa de ahorro de costes, pero viable a los convencionales aparatos de plasma de oxígeno, 21,22 de plasma tratar el lado estampado de la PDMS y una limpieza de 3 "x 1" portaobjetos de vidrio con un manual de laboratorio Tratamiento de corona (Electro-Técnica Products Inc .) 23. Tenga en cuenta que este dispositivo se debe utilizar en una campana de humos o área bien ventilada, debido a la descarga de ozono, y todos los relojes y teléfonos celulares se deben mantener por lo menos diez pies de distancia. Ajustar la descarga en corona para alcanzar una corona estable con un mínimo de chispas. Poco a poco agitar el electrodo aproximadamente 1/4 "por encima de la superficie de cada unos 20 segundos y luego poner inmediatamente las superficies tratadas en contacto para formar una fuerte unión permanente antes de que las superficies de PDMS volver a su estado natal.
  9. Coloque el aparato sobre una placa de metal, colocar en un horno frío, ponga el horno a 120 ° C y hornear durante toda la noche para completar la unión y para devolver el PDMS a su estado hidrofóbico original. 24 Durante este horno de alta temperatura, tque la superficie de vidrio del canal también se representará hidrófobo debido a la deposición de una capa hidrófoba delgada sobre el vidrio. Alternativamente, los recubrimientos hidrófobos tales como Aquapel (PPG Industries) puede ser inyectado en los puertos de fluidos utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de la jeringa. 12 cuidadosamente pero con firmeza inyectar el Aquapel seguido de purga de aire en los puertos de fluidos sin romper el vidrio a PDMS enlace . Agresivamente repetir la purga de aire en todos los puertos de entrada y salida, mientras limpiando cualquier exceso Aquapel con el fin de evitar los depósitos que pueden obstruir los canales durante el secado.

2. Preparación de la muestra

  1. Preparar un cultivo de células de acuerdo a los procedimientos establecidos para el tipo celular elegido. Para el dispositivo particular usado en este estudio, 8-15 micras partículas o células adecuadamente debe ordenar para la encapsulación. Más pequeñas o más grandes tipos de células pueden requerir cambiar las dimensiones del canal de enfoque para lograr p Re adecuada. Para el meresultados thod demostración se muestra en este trabajo, el 9,9 micras microesferas de poliestireno (G1000, Thermo Scientific) se utilizan como sustitutos de células.
  2. Preparar la partícula acuosa o suspensión de células a través de la mezcla suave. Cuando se usan células o partículas de poliestireno, el control de la concentración es esencial (véase Figura 4) para alcanzar la encapsulación ideales ordenado. Utilizando los datos anteriores 12 como una guía, calcular la celda deseada o la concentración de partículas basado en el espaciamiento tren ordenado y micro-canal tamaño como: una célula o partícula por esperados veces longitudinales del tren de espaciamiento del canal centrado en sección transversal de la zona. Si la concentración de valores (1% w / w) es insuficiente, aumentar la concentración (en este caso a 1,5% w / w) por centrifugación suavemente la muestra de stock, la eliminación de líquido sobrenadante, y re-suspensión de las partículas por un mezclador vortex, o más suave mezclado utilizando células. Preparar un volumen adecuado para tener en cuenta el volumen deseado y recogida por el tiempo de ejecución asociado con flujo de sintonía.
  3. Tanto las células y partículas de poliestireno tienen un peso específico mayor que uno. Aunque no se ha demostrado en este protocolo, para experimentos a largo plazo con una duración del orden de varios minutos a horas, la flotabilidad que coincida con la solución mediante la adición de un soluto, como CaCl 2 para partículas o OptiPrep (Sigma-Aldrich) para las células.
  4. Preparar una muestra de 10 ml de la fase continua de aceite de hidrocarburo fluorado mezclando el aceite fluorocarbonado FC-40 (3M) y PFPE-PEG bloque copolímero tensioactivo 25 (2,5% w / w) (RainDance Technologies) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Alternativamente, el aceite mineral ligero (Productos químicos de proceso PTI) puede ser utilizado con ABIL-EM 90 tensioactivo (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Montaje experimental

  1. Encienda el microscopio invertido óptica (Axio Observer, Zeiss) y cámara de alta velocidad (Phantom V310, Visión de Investigación). Enfoque e inspeccionar las canales de los zuecos y los desechos, ya sea moviendo manualmente el dispositivo omediante el uso de una platina del microscopio motorizado. Algunos residuos de pequeño tamaño pueden ser empujados a cabo cuando el líquido fluye a través de. Para residuos de gran tamaño u obstrucciones evidentes, seleccione otro canal en el dispositivo como los desechos en el canal centrado puede degradar significativamente la calidad de pedido. Tenga en cuenta que obstruye a menudo puede ser removido en virtud de flujo, presionando firmemente sobre la superficie de PDMS sobre la región afectada con unas pinzas romas.
  2. Corte tres trozos de tubo de PVC (0,01 "ID/0.03" de diámetro exterior, Tygon) para la entrada de la acuosa, de entrada y salida de aceite, emulsión. Para reducir al mínimo el volumen muerto, cortado lo suficiente como para llegar a la tubería de las bombas de jeringa de la platina del microscopio. Corte los extremos de tubería en un ángulo de 45 ° para facilitar la inserción en los puertos de fluidos.
  3. Utilice pinzas para presionar encajar el tubo termina en los puertos de fluidos perforados en el paso 1 y luego presione encajar dos de calibre 30 de acero inoxidable con puntas romas agujas de jeringas de acero (SmallParts) en los extremos libres de la fase acuosa respectivo y tubos de entrada de aceite (sin adhesivo es necesario) . Coloque el tubo de salida en una r de residuoseservoir. Este tubo más tarde se trasladó a un depósito de recogida.
  4. Mueva el dispositivo y el tubo conectado a la platina del microscopio, alinear, y se centran en la boquilla del dispositivo, utilizando un objetivo disponible (20x fue utilizado para este experimento). Ajustar para obtener el K hler iluminación y otros ajustes del microscopio como se requiere para una grabación óptima.
  5. Llenar una jeringa de 1 ml (BD) con la fase acuosa bien mezclada y una jeringa de 3 ml (BD) con la solución de la fase aceite preparado en el Paso 2. Tenga en cuenta que las jeringas de un determinado volumen puede ser utilizada y debe ser cuidadosamente seleccionados en función de los tiempos de ejecución deseados y la minimización de cualquier pulsatilidad. Incline una jeringa vertical y con un tirón para mover las burbujas de aire a la salida de la jeringa. Lentamente presione el émbolo lo suficiente como para empujar el aire hacia la punta de la jeringa. Sosteniendo la jeringa vertical, conectar las jeringas a la aguja de la jeringa respectiva ya conectada al dispositivo en el Paso 3,3. Presione el émbolo para forzar el aire a través de la aguja de la jeringa el volumen muerto hasta que el líquido es pushed a través del tubo casi al dispositivo. Monte firmemente la jeringa en una bomba de jeringa (Nexus 3000, Chemyx) y activar el bloqueo del émbolo. Repita las conexiones para la segunda jeringa y montar a una bomba de segunda jeringa.
  6. Potencia en cada bomba de jeringa y el programa utilizando los protocolos del fabricante de la bomba. Establecer los caudales iniciales a Q aceite = 50 l / min y aq Q = 5 l / min para la fase oleosa y fase acuosa, respectivamente. Inicio de las bombas.
  7. Espere a que cada fluido para entrar en el dispositivo y llenar los canales, empujando hacia fuera el aire que queda muerta. Esto puede tardar varios minutos. Si hay una gran cantidad de aire en la tubería de entrada, aumentar temporalmente cada velocidad de flujo hasta que el aire es expulsado. No aumentar las tasas de flujo tan altas que se producen grandes presiones en el canal, que podría dar lugar a fallo de la unión de PDMS-a-vidrio.
  8. Uso de los caudales iniciales, se observa la formación de gotas en la boquilla (los resultados se muestra aquí: 20x magnification, 21005 fps velocidad de fotogramas, la exposición a 3 ms). Reducir el campo de vista de la cámara sólo la boquilla para maximizar la velocidad de cuadro y reducir los requisitos de memoria, si es posible. Captura de vídeos de muestra y confirmar que la tasa de muestreo es el adecuado para evitar el aliasing.
  9. Para evitar la inyección (ver Figura 2), comience con las bajas tasas de flujo acuoso. Lentamente aumentar la velocidad de flujo acuoso para observar ordenamiento de partículas en el canal de solución acuosa largo medida que aumenta la velocidad de flujo.
  10. Si la concentración de partículas es demasiado baja para proporcionar trenes con relativamente pocas "falta" partículas y la muestra no fue acompañado de flotabilidad, físicamente inclinar la bomba de jeringa hacia la salida de la jeringa para proporcionar gradual sedimentación de partículas hacia la salida de la jeringa. Este método se muestra en el protocolo de vídeo. Periódicamente girar la jeringa a lo largo de su eje también puede reducir sedimentación no deseado.
  11. Una vez que se produce ordenamiento adecuado, regular el caudal de aceite para sintonizar la frecuencia de generación ytamaño de las gotas. El volumen de la gota media puede calcularse utilizando la tasa de flujo acuoso dividida por la frecuencia de generación gota, medida por la captura de vídeo. Iterativamente ajustar tanto las tasas de flujo para lograr las tasas deseadas de encapsulación y el volumen de la gota.
  12. Encapsulación ordenado Una vez estable se confirma, mover el tubo de salida desde el depósito de residuos en un depósito de recogida o alimentar en otro dispositivo para pruebas posteriores.
  13. Determinar el tiempo de recogida basada en el número deseado de gotas y la frecuencia de generación calculado.
  14. Anotar la fracción de gotas que contienen 0, 1, 2, ..., N partículas para cuantificar la eficiencia utilizando ya sea gota video resultados generación o pipeteando una muestra de emulsión recogieron para su inspección.

4. Los resultados representativos

Los resultados se presentan que lograr tanto una partícula controlado y controlado doble partícula encapsulación (Figura 3). Al reducirla velocidad de flujo del FC-40 aceite en un medio, de una sola partícula de encapsulación se convierte en dos partículas de encapsulación. Por el contrario, se podría haber aumentado la velocidad de flujo acuoso para suministrar partículas a la boquilla de forma más rápida, pero también nos han aumentado el riesgo de inyección de la corriente acuosa. Los histogramas en la Figura 3 se presenta el número fraccionario de partículas por caída de los dos casos, junto con las comparaciones con las estadísticas de Poisson. Las gotas ocasionales con partículas de cero se deben principalmente a "desaparecido" las partículas en los trenes solicitados, mientras que los casos en que hay más partículas encapsuladas que resultado deseado de locales altas concentraciones de partículas y las partículas que a veces emigran hacia una de las dos posiciones verticales de enfoque. Tenga en cuenta que la flotabilidad juego tal como se describe en la Sección 2 no se utilizó. En su lugar, la bomba de jeringa se inclina físicamente para permitir la sedimentación de partículas hacia la salida de la jeringa, que conduce a una alta concentración de partículas durante la carrera.

Una carrera experimental que ilustra la necesidad de partícula adecuado y las concentraciones de células se muestra en la Figura 4. Sin orden completa, grupos locales de orden y se encapsulan las partículas, pero muchas gotas son sin partículas. Un histograma muestra la disminución de la eficiencia de encapsulación para la encapsulación de partículas deseado dos.

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Figura 1. Dispositivo de encapsulación. a) En general el dispositivo con las entradas, salida y el canal de largo el pedido. La altura del dispositivo es de 52 micras y el ancho del canal de pedido es de 27 micras. b) Tanto acuosa y entradas de petróleo tienen filtros grandes escombros con huecos en el orden de la anchura del canal de pedido para la vista ampliada de la entrada de aceite. c) La vista ampliada de la boquilla muestra la misma anchura de canal de 27 m para los canales acuosos y aceite, seguido por la contracción de la boquilla de 22 micras y la expansión súbita a un canal más ancho 61 micras.Tenga en cuenta que las dimensiones del dispositivo que se muestran aquí han sido verificadas mediante un perfilómetro después de la microfabricación y difieren ligeramente de las dimensiones nominales de la máscara. Una verdadera imagen del canal de pedidos y la boquilla están disponibles en línea, como la figura de consulta 1 . El archivo de máscara de AutoCAD también ha sido incluido en línea como un suplemento a este manuscrito.

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Figura 2. Histéresis de un goteo de transición chorro usando un dispositivo más amplio (80 micras de ancho x 22 m de altura). a) A velocidad constante FC-40 de flujo (Q aceite = 45 l / min), la formación de descenso constante se produce a 10 kHz utilizando una solución acuosa de caudal Q aq = 8 l / min. A medida que la tasa de flujo acuoso se incrementa lentamente a 10 y mu, l / min, chorro de la corriente de fluido acuoso se dispara. b) Cuando el caudal es devuelto a 8 l / min chorro sigue. Tenga en cuenta que la formación de gotas constante puede ser re-establecido por la breve pausa de la bomba de flujo acuoso (una pausa de 1 segundo es típico).

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Figura 3. Encapsulación individual o doble-partícula. Una formación de gotas) con una célula por gota (Q aceite = 60 l / min, Q aq = 9 l / min) con una tasa de generación de gota de 6,1 kHz, el tamaño promedio de gota 24.4 PL, y una eficiencia de captura de una sola célula D k = 79,5% y K p = 83,7% (λ = 0,95) para un tamaño de muestra de n = 517 gotas d y n p = 491 partículas. b) la formación de gotas con dos celdas por gota se consigue simplemente mediante la reducción de la FC-40 caudal Q de aceite a 30 μL / min. Los más grandes (39,8 pL) gotas se forman a un ritmo de 3,8 kHz con una eficiencia de captura de dos células D k = 71,5% y P = k el 79,5% (λ = 1,80) para un tamaño de muestra de n d = 383 gotas y n p = 689 partículas. cd) Dos histogramas de comparar la eficiencia de encapsulación de partículas gota D k de la encapsulación ordenó una y dos partículas con las estadísticas de Poisson (encapsulado al azar). Nótese que en ambos casos, el espaciamiento de las partículas en la dirección del flujo es de aproximadamente 17-18 micras para totalmente ordenadas, partículas que se alternan. Vídeos complementarios que muestran tanto la encapsulación de uno y dos partículas están disponibles en línea. Haga clic aquí para ver la 3a suplementarios Película . Haga clic aquí para ver la película 3b suplementarios .

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Concentración Figura 4. Afecta grandemente la eficiencia de encapsulación. A) A medida que disminuye la concentración, el ordenamiento completo no se produce, y así "agujeros" en los trenes de emerger, dejando unas gotas con menos de partículas previstos. B) El histograma muestra la disminución de la eficiencia ( D k = 55,9%, p k = 70,9%) para la encapsulación de dos partículas debido a un menor valor de λ = 1,57 donde hay casi la misma cantidad de una sola partícula cae a medida que hay doble de partículas gotas. Esta cifra es el resultado de aceite Q = 30 l / min y aq Q = 9 l / min, las condiciones de flujo mismas para la Figura 3b. Un video suplementario representante está disponible en línea. Haga clic aquí para ver la película de consulta 4 .

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Discusión

A pesar de grados relativamente altos de pedidos, no todas las gotas contendrá el número apropiado de partículas o células. Eficiencia de encapsulación puede ser calculada como el número de células o partículas que quedan encapsulados en gotas con la ocupación deseado dividido por su número total. Estos datos en bruto se puede obtener ya sea desde un sistema automatizado de algoritmo de video de alta velocidad o de imágenes de una muestra de emulsión de recogida. Esto puede ser comparado con la fracción de partícula...

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Divulgaciones

JE es un inventor de una patente en trámite sobre la base de la tecnología utilizada en este manuscrito.

Agradecimientos

Damos las gracias a RainDance Technologies para la muestra de PFPE-PEG surfactante utilizado en este estudio, y agradecemos al Centro de Recursos de BioMEMS (Mehmet Toner, director) para el molde de obleas de silicio para crear réplicas de los canales de PDMS.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
AutoCAD AutoDesk
Transparencia Máscara Fineline Imaging Inc.
SU-8 Fotoresinas MicroChem 2050
Dektak Perfilómetro Veeco
Petri BD Falcon 351058
Kit de elastómero de silicona PDMS Dow Corning Corp. Sylgard 184, Número de material (240) 4019862
Desecador de vacío Jencons 250-030
Bomba de vacío Alcatel Vacuum Technology 2010 C2
Regulador de vacío Cole-Parmer EW-00910-10
Horno Thermo Scientific Lindberg Blue M, OV800F
Biopsia en sacabocados, 0,75 mm Harris Uni-Core 15072
Laboratorio de Tratamiento de corona Electrotécnica Products Inc. BD-20AC, SKU 12051A
Las láminas de vidrio Sello de Oro 3010
Aquapel PPG Industries Estrategia Alternativa
Microesferas de poliestireno, 9,9 m Thermo G1000
OptiPrep Sigma-Aldrich D1556 No se ha demostrado
Jeringas Luer-Lok BD 1 ml: 309628
3 ml: 309585
FC-40 fluorocarbono aceite 3M Inc. Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG fluorotensioactivo RainDance Tecnologías
Aceite mineral ligero PTI Productos químicos de proceso 08042-47-5 Estrategia Alternativa
Mineral de surfactante de aceite Evonik Goldschmidt Corporación Abil EM 90 Estrategia Alternativa
Tygon tubo de PVC SmallParts TGY-010
Calibre 30 Luer-Lok de agujas y jeringas, 1/2 " SmallParts NE-301PL-C
Microscopio invertido Carl Zeiss de imágenes Axio Observer.Z1
Cámara de alta velocidad Investigación de la Visión Phantom V310
Las bombas de jeringa (2) Chemyx Inc. Nexus 3000
Aceite de silicona Dow Corning 200 fluido, 10 cSt Opcional para el almacenamiento de emulsión

Referencias

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