De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

Summary

La combinación de generación monodispersas gota con ordenamiento inercial de células y partículas, se describe un método para encapsular un número deseado de células o partículas en una sola gota a tasas kHz. Se demuestra la eficiencia de dos veces superiores a las de la encapsulación no ordenada de las gotas de una y dos partículas.

Abstract

Los métodos de encapsulación microfluídica se han utilizado previamente para capturar células en gotas acuosas monodispersas a escala de picolitros, proporcionando confinamiento desde un entorno de fluido a granel con aplicaciones en cribado de alto rendimiento, citometría y espectrometría de masas. Describimos un método no solo para encapsular células individuales, sino para capturar repetidamente un número determinado de células (aquí demostramos la encapsulación de una y dos células) para estudiar tanto el aislamiento como las interacciones entre células en grupos de tamaños controlados. Al combinar técnicas de generación de gotas con el ordenamiento de celdas y partículas, demostramos la encapsulación controlada de partículas del tamaño de una celda para una encapsulación eficiente y continua. Utilizando una suspensión acuosa de partículas y aceite de fluorocarbono inmiscible, generamos gotas acuosas en aceite con una boquilla de enfoque de flujo. El caudal acuoso es lo suficientemente alto como para crear un ordenamiento de las partículas que llegan a la boquilla a múltiples frecuencias enteras de la frecuencia de generación de gotas, encapsulando un número controlado de celdas en cada gota. Para obtener resultados representativos, se utilizan partículas de poliestireno de 9,9 μm como sustitutos celulares. Este estudio muestra una eficiencia de encapsulación de una sola partícula P_k=1 del 83,7% y una eficiencia de encapsulación de doble partícula P_k=2 del 79,5% en comparación con sus respectivas eficiencias de Poisson del 39,3% y 33,3%, respectivamente. Se ha demostrado que el efecto de una concentración constante de células y partículas es de gran importancia para una encapsulación eficiente, y también se abordan las transiciones de goteo a chorro.

Introducción

Las suspensiones celulares acuosas de medios continuos comparten un entorno fluido común que permite que las células interactúen en paralelo y también homogeneiza los efectos de células específicas en las mediciones del medio. La encapsulación de alto rendimiento de las células en gotas a escala de picolitros confina las muestras para proteger las gotas de la contaminación cruzada, permite medir la diversidad celular dentro de las muestras, evita la dilución de los reactivos y los biomarcadores expresados, y amplifica las señales de los productos del biorreactor. Las gotas también brindan la capacidad de volver a fusionar gotas en muestras acuosas más grandes o con otras gotas para estudios de señalización intercelular. ^1,2 La reducción de la dilución implica señales de detección más fuertes para mediciones de mayor precisión, así como la capacidad de reducir los volúmenes de muestras y reactivos potencialmente costosos. ³ La encapsulación de células en gotas se ha utilizado para mejorar la detección de la expresión de proteínas,4 anticuerpos,5,6 enzimas,7 y la actividad metabólica⁸ para el cribado de alto rendimiento, y podría utilizarse para mejorar la citometría de alto rendimiento. ⁹ Estudios adicionales presentan aplicaciones en bio-electrospray de gotas que contienen celdas para espectrometría de masas¹⁰ y recubrimientos de celdas de superficie dirigidas. ¹¹ Algunas aplicaciones, sin embargo, se han visto limitadas por la falta de capacidad para controlar el número de células encapsuladas en gotas. Aquí presentamos un método de encapsulación ordenada¹² que aumenta las eficiencias de encapsulación demostradas para una y dos celdas y puede extrapolarse para la encapsulación de un mayor número de celdas.

Para lograr la generación de gotas monodispersas, el "enfoque de flujo" microfluídico permite la creación de gotas de tamaño controlable de un fluido (una mezcla de celdas acuosas) dentro de otro (una fase de aceite continuo) mediante el uso de una boquilla en la que convergen las corrientes. ¹³ Para una geometría de boquilla dada, la frecuencia de generación de gotas f y el tamaño de la gota se pueden modificar ajustando los caudales de aceite y acuosos Q_oil y Q_aq. A medida que aumentan los caudales, los flujos pueden pasar de la generación de gotas a la inyección inestable de fluido acuoso desde la boquilla. ¹⁴

Cuando la solución acuosa contiene partículas en suspensión, las partículas se encapsulan y se aíslan unas de otras en la boquilla. Para la generación de gotas utilizando una suspensión de células acuosas distribuidas aleatoriamente, la fracción media de gotas D_k que contienen k células está dictada por el estadístico de Poisson, donde D_k = λ^k exp(-λ)/(k!) y λ es el número medio de células por gota. La fracción de celdas que terminan en las gotas encapsuladas "correctamente" se calcula usando P_k = (k x D_k)/Σ(k' x D_k'). La diferencia sutil entre las dos métricas es que D_k se relaciona con la utilización de fluido acuoso y la cantidad de clasificación de gotas que debe completarse después de la encapsulación, y P_k se relaciona con la utilización de la muestra de celda. Por ejemplo, se podría usar una suspensión celular diluida (λ baja) para encapsular gotas donde la mayoría de las gotas que contienen células contendrían solo una célula. Mientras que la métrica de eficiencia P_k sería alta, la mayoría de las gotas estarían vacías (D_k bajo), lo que requeriría un mecanismo de clasificación para eliminar las gotas vacías, lo que también reduciría el rendimiento. ¹⁵

La combinación de la generación de gotas con el orden inercial proporciona la capacidad de encapsular gotas con un número más predecible de celdas por gota y mayores rendimientos que la encapsulación aleatoria. El enfoque inercial fue descubierto por primera vez por Segre y Silberberg¹⁶ y se refiere a la tendencia de las partículas de tamaño finito a migrar a posiciones de equilibrio lateral en el flujo del canal. El ordenamiento inercial se refiere a la tendencia de las partículas y células a organizarse pasivamente en trenes de velocidad constante, escalonados e igualmente espaciados. Tanto el enfoque como el pedido requieren caudales suficientemente altos (número de Reynolds alto) y tamaños de partícula (número de Reynolds de partícula alto). ^17,18 Aquí, el número de Reynolds Re = uD_h / ν y la partícula Número de Reynolds Rep = Re(a / D_h)², donde u es una velocidad de flujo característica, D_h [= 2wh / (w + h)] es el diámetro hidráulico, ν es la viscosidad cinemática, a es el diámetro de la partícula, w es el ancho del canal y h es la altura del canal. Empíricamente, la longitud requerida para lograr trenes completamente ordenados disminuye a medida que Re y Re_p aumentan. Tenga en cuenta que los altos requisitos de Re y Re_p (para este estudio del orden de 5 y 0,5, respectivamente) pueden entrar en conflicto con la necesidad de mantener bajos los caudales acuosos para evitar chorros en la boquilla de generación de gotas. Además, los altos caudales conducen a mayores tensiones de cizallamiento en las celdas, que no se abordan en este protocolo. El estudio de encapsulación ordenada anterior demostró que más del 90% de las células HL60 encapsuladas individualmente en condiciones de flujo similares a las de este estudio mantuvieron la integridad de la membrana celular. ¹² Sin embargo, el efecto de la magnitud y las escalas de tiempo de los esfuerzos cortantes deberá considerarse cuidadosamente al extrapolar a diferentes tipos de celdas y parámetros de flujo. La superposición de las restricciones de caudal acuoso de la ordenación de las celdas, la generación de gotas y la viabilidad de las celdas proporciona un régimen operativo ideal para la encapsulación controlada de celdas simples y múltiples.

Debido a que muy pocos estudios abordan el espaciamiento entre ^trenes,19,20 determinar el espaciamiento se realiza más fácilmente empíricamente y dependerá de la geometría del canal, el caudal, el tamaño de partícula y la concentración de partículas. No obstante, el espaciado lateral igual entre los trenes implica que las celdas llegan a intervalos de tiempo predecibles y consistentes. Cuando la generación de gotas se produce a la misma velocidad a la que las células ordenadas llegan a la boquilla, las células se encapsulan dentro de la gota de forma controlada. Esta técnica se ha utilizado para encapsular células individuales con rendimientos del orden de 15 kHz,12 una mejora significativa con respecto a estudios anteriores que informan tasas de encapsulación del orden de 60-160 Hz.4,15 En el trabajo de encapsulación controlada, más del 80% de las gotas contenían una y solo una celda, una mejora significativa de la eficiencia con respecto a las estadísticas de Poisson (aleatorias), lo que predice menos del 40% de eficiencia en promedio. ¹²

En el trabajo previo de encapsulación ^{controlada,12} el número promedio de partículas por gota λ se ajustó para proporcionar encapsulación de una sola célula. Nuestra hipótesis es que a través del ajuste de las tasas de flujo, podemos encapsular de manera eficiente cualquier número de celdas por gota cuando λ es igual o cercano al número deseado de celdas por gota. Mientras que la encapsulación de una sola célula es valiosa para determinar las respuestas de las células individuales a los estímulos, la encapsulación de múltiples células proporciona información relacionada con la interacción de números y tipos controlados de células. Aquí presentamos un protocolo, resultados representativos utilizando microesferas de poliestireno y una discusión para la encapsulación controlada de múltiples celdas utilizando un canal de ordenamiento inercial pasivo y una boquilla de generación de gotas.

Protocol

Los protocolos de esta sección describen los materiales y equipos utilizados específicamente para obtener los resultados experimentales presentados. Tenga en cuenta que los proveedores alternativos para los productos químicos y equipos pueden ser utilizados.

1. Fabricación de los dispositivos y la litografía blanda

Las técnicas estándar de la litografía blanda, ²¹ algunos de los cuales se han presentado en los artículos anteriores JOVE, ²² se utilizaron para la creación de polidimetilsiloxano (PDMS) las redes de microcanales adheridos a sustratos de vidrio. Aparte de fabricación del molde maestro réplica por SU-8 fotolitografía, los procesos pueden llevarse a cabo fuera de una sala limpia o campana limpia, sin embargo, el polvo y las partículas aún debe ser minimizada para lograr resultados consistentes.

1. Diseño de un patrón de micro-canal como se muestra en la Figura 1 en AutoCAD (Autodesk Inc.). Emplear a un fabricante de terceros (Fineline Imaging Inc.) para imprimir una alta resolución (50.000 ppp) transtransparencia en la máscara de la película de Mylar o de cuarzo, donde los canales son transparentes sobre un fondo oscuro.
2. Crear un silicio y SU-8 amo fotosensible para el moldeo de réplica. Brevemente, girar SU-8 2050 (MicroChem) fotorresistencia negativa con rpm recomendado por el fabricante en un spin-revestidor para crear una capa de 52 micras de espesor sobre una superficie limpia de 7,5 cm o 10 cm de obleas de silicio. Después de hornear suave, con el borde la eliminación de cuentas, los rayos UV a través de una máscara de contacto, al horno después de la exposición, desarrollo y exposición a inundaciones, medir el espesor real de la capa de SU-8 mediante un perfilómetro Dektak (Veeco). Cinta del molde maestro en el fondo de un 4 "o 5" placa de Petri para preparar PDMS moldeo réplica.
3. Mezcla PDMS base de elastómero con el agente de curado elastómero (Dow Corning) en una relación 10:1 w / w de base para el agente de curado. Verter bien mezclada precursor de PDMS en el patrón de silicio para crear una capa de 2-3 mm de espesor final. Una mezcla de 20 g de base de elastómero con 2 g de agente de curado es suficiente para cubrir un 4 "superficie diámetro.
4. Coloque el master molde y PDMS en el desecador de vacío (Jencons) para des-gas no curado PDMS. El uso de un regulador de presión (Cole Parmer), lentamente disminuir la presión manométrica de 0 cámara "de Hg a -27" Hg durante 20 minutos para evitar la excesiva formación de espuma. Deje el dispositivo en la cámara de vacío a -27 "Hg durante 30 minutos o hasta que las burbujas de aire desaparezcan.
5. De liberación de vacío y mover el molde maestro y PDMS a un horno de 65 ° C (Thermo Scientific) durante un mínimo de cuatro horas. El dispositivo se puede dejar en el horno durante la noche para mejorar el curado.
6. Retire el dispositivo del horno y dejar enfriar. Corte cuidadosamente alrededor de la oblea PDMS circular usando un cuchillo de precisión y la cáscara de PDMS. Cortar contorno dispositivo como se muestra en la Figura 1 con un escalpelo.
7. Ponche de fluidos puertos (tres por equipo) en las tres regiones circunvecinas se muestra en la Figura 1 con una biopsia por punción. Para este dispositivo, use un 0,75 mm de diámetro exterior de golpe (Harris).
8. Adherirse cinta adhesiva al lado del patrón y la cáscara de PDMS para eliminar cualquierpolvo. Como una alternativa de ahorro de costes, pero viable a los convencionales aparatos de plasma de oxígeno, ^21,22 de plasma tratar el lado estampado de la PDMS y una limpieza de 3 "x 1" portaobjetos de vidrio con un manual de laboratorio Tratamiento de corona (Electro-Técnica Products Inc .) ^23. Tenga en cuenta que este dispositivo se debe utilizar en una campana de humos o área bien ventilada, debido a la descarga de ozono, y todos los relojes y teléfonos celulares se deben mantener por lo menos diez pies de distancia. Ajustar la descarga en corona para alcanzar una corona estable con un mínimo de chispas. Poco a poco agitar el electrodo aproximadamente 1/4 "por encima de la superficie de cada unos 20 segundos y luego poner inmediatamente las superficies tratadas en contacto para formar una fuerte unión permanente antes de que las superficies de PDMS volver a su estado natal.
9. Coloque el aparato sobre una placa de metal, colocar en un horno frío, ponga el horno a 120 ° C y hornear durante toda la noche para completar la unión y para devolver el PDMS a su estado hidrofóbico original. ²⁴ Durante este horno de alta temperatura, tque la superficie de vidrio del canal también se representará hidrófobo debido a la deposición de una capa hidrófoba delgada sobre el vidrio. Alternativamente, los recubrimientos hidrófobos tales como Aquapel (PPG Industries) puede ser inyectado en los puertos de fluidos utilizando una jeringa de 1 ml y una aguja de la jeringa. ¹² cuidadosamente pero con firmeza inyectar el Aquapel seguido de purga de aire en los puertos de fluidos sin romper el vidrio a PDMS enlace . Agresivamente repetir la purga de aire en todos los puertos de entrada y salida, mientras limpiando cualquier exceso Aquapel con el fin de evitar los depósitos que pueden obstruir los canales durante el secado.

2. Preparación de la muestra

1. Preparar un cultivo de células de acuerdo a los procedimientos establecidos para el tipo celular elegido. Para el dispositivo particular usado en este estudio, 8-15 micras partículas o células adecuadamente debe ordenar para la encapsulación. Más pequeñas o más grandes tipos de células pueden requerir cambiar las dimensiones del canal de enfoque para lograr _p Re adecuada. Para el meresultados thod demostración se muestra en este trabajo, el 9,9 micras microesferas de poliestireno (G1000, Thermo Scientific) se utilizan como sustitutos de células.
2. Preparar la partícula acuosa o suspensión de células a través de la mezcla suave. Cuando se usan células o partículas de poliestireno, el control de la concentración es esencial (véase Figura 4) para alcanzar la encapsulación ideales ordenado. Utilizando los datos anteriores ¹² como una guía, calcular la celda deseada o la concentración de partículas basado en el espaciamiento tren ordenado y micro-canal tamaño como: una célula o partícula por esperados veces longitudinales del tren de espaciamiento del canal centrado en sección transversal de la zona. Si la concentración de valores (1% w / w) es insuficiente, aumentar la concentración (en este caso a 1,5% w / w) por centrifugación suavemente la muestra de stock, la eliminación de líquido sobrenadante, y re-suspensión de las partículas por un mezclador vortex, o más suave mezclado utilizando células. Preparar un volumen adecuado para tener en cuenta el volumen deseado y recogida por el tiempo de ejecución asociado con flujo de sintonía.
3. Tanto las células y partículas de poliestireno tienen un peso específico mayor que uno. Aunque no se ha demostrado en este protocolo, para experimentos a largo plazo con una duración del orden de varios minutos a horas, la flotabilidad que coincida con la solución mediante la adición de un soluto, como CaCl ₂ para partículas o OptiPrep (Sigma-Aldrich) para las células.
4. Preparar una muestra de 10 ml de la fase continua de aceite de hidrocarburo fluorado mezclando el aceite fluorocarbonado FC-40 (3M) y PFPE-PEG bloque copolímero tensioactivo ²⁵ (2,5% w / w) (RainDance Technologies) en un tubo de centrífuga de 15 ml. Alternativamente, el aceite mineral ligero (Productos químicos de proceso PTI) puede ser utilizado con ABIL-EM 90 tensioactivo (2,5% w / w) (Evonik Goldschmidt Corporation).

3. Montaje experimental

1. Encienda el microscopio invertido óptica (Axio Observer, Zeiss) y cámara de alta velocidad (Phantom V310, Visión de Investigación). Enfoque e inspeccionar las canales de los zuecos y los desechos, ya sea moviendo manualmente el dispositivo omediante el uso de una platina del microscopio motorizado. Algunos residuos de pequeño tamaño pueden ser empujados a cabo cuando el líquido fluye a través de. Para residuos de gran tamaño u obstrucciones evidentes, seleccione otro canal en el dispositivo como los desechos en el canal centrado puede degradar significativamente la calidad de pedido. Tenga en cuenta que obstruye a menudo puede ser removido en virtud de flujo, presionando firmemente sobre la superficie de PDMS sobre la región afectada con unas pinzas romas.
2. Corte tres trozos de tubo de PVC (0,01 "ID/0.03" de diámetro exterior, Tygon) para la entrada de la acuosa, de entrada y salida de aceite, emulsión. Para reducir al mínimo el volumen muerto, cortado lo suficiente como para llegar a la tubería de las bombas de jeringa de la platina del microscopio. Corte los extremos de tubería en un ángulo de 45 ° para facilitar la inserción en los puertos de fluidos.
3. Utilice pinzas para presionar encajar el tubo termina en los puertos de fluidos perforados en el paso 1 y luego presione encajar dos de calibre 30 de acero inoxidable con puntas romas agujas de jeringas de acero (SmallParts) en los extremos libres de la fase acuosa respectivo y tubos de entrada de aceite (sin adhesivo es necesario) . Coloque el tubo de salida en una r de residuoseservoir. Este tubo más tarde se trasladó a un depósito de recogida.
4. Mueva el dispositivo y el tubo conectado a la platina del microscopio, alinear, y se centran en la boquilla del dispositivo, utilizando un objetivo disponible (20x fue utilizado para este experimento). Ajustar para obtener el K hler iluminación y otros ajustes del microscopio como se requiere para una grabación óptima.
5. Llenar una jeringa de 1 ml (BD) con la fase acuosa bien mezclada y una jeringa de 3 ml (BD) con la solución de la fase aceite preparado en el Paso 2. Tenga en cuenta que las jeringas de un determinado volumen puede ser utilizada y debe ser cuidadosamente seleccionados en función de los tiempos de ejecución deseados y la minimización de cualquier pulsatilidad. Incline una jeringa vertical y con un tirón para mover las burbujas de aire a la salida de la jeringa. Lentamente presione el émbolo lo suficiente como para empujar el aire hacia la punta de la jeringa. Sosteniendo la jeringa vertical, conectar las jeringas a la aguja de la jeringa respectiva ya conectada al dispositivo en el Paso 3,3. Presione el émbolo para forzar el aire a través de la aguja de la jeringa el volumen muerto hasta que el líquido es pushed a través del tubo casi al dispositivo. Monte firmemente la jeringa en una bomba de jeringa (Nexus 3000, Chemyx) y activar el bloqueo del émbolo. Repita las conexiones para la segunda jeringa y montar a una bomba de segunda jeringa.
6. Potencia en cada bomba de jeringa y el programa utilizando los protocolos del fabricante de la bomba. Establecer los caudales iniciales a Q _aceite = 50 l / min y _aq Q = 5 l / min para la fase oleosa y fase acuosa, respectivamente. Inicio de las bombas.
7. Espere a que cada fluido para entrar en el dispositivo y llenar los canales, empujando hacia fuera el aire que queda muerta. Esto puede tardar varios minutos. Si hay una gran cantidad de aire en la tubería de entrada, aumentar temporalmente cada velocidad de flujo hasta que el aire es expulsado. No aumentar las tasas de flujo tan altas que se producen grandes presiones en el canal, que podría dar lugar a fallo de la unión de PDMS-a-vidrio.
8. Uso de los caudales iniciales, se observa la formación de gotas en la boquilla (los resultados se muestra aquí: 20x magnification, 21005 fps velocidad de fotogramas, la exposición a 3 ms). Reducir el campo de vista de la cámara sólo la boquilla para maximizar la velocidad de cuadro y reducir los requisitos de memoria, si es posible. Captura de vídeos de muestra y confirmar que la tasa de muestreo es el adecuado para evitar el aliasing.
9. Para evitar la inyección (ver Figura 2), comience con las bajas tasas de flujo acuoso. Lentamente aumentar la velocidad de flujo acuoso para observar ordenamiento de partículas en el canal de solución acuosa largo medida que aumenta la velocidad de flujo.
10. Si la concentración de partículas es demasiado baja para proporcionar trenes con relativamente pocas "falta" partículas y la muestra no fue acompañado de flotabilidad, físicamente inclinar la bomba de jeringa hacia la salida de la jeringa para proporcionar gradual sedimentación de partículas hacia la salida de la jeringa. Este método se muestra en el protocolo de vídeo. Periódicamente girar la jeringa a lo largo de su eje también puede reducir sedimentación no deseado.
11. Una vez que se produce ordenamiento adecuado, regular el caudal de aceite para sintonizar la frecuencia de generación ytamaño de las gotas. El volumen de la gota media puede calcularse utilizando la tasa de flujo acuoso dividida por la frecuencia de generación gota, medida por la captura de vídeo. Iterativamente ajustar tanto las tasas de flujo para lograr las tasas deseadas de encapsulación y el volumen de la gota.
12. Encapsulación ordenado Una vez estable se confirma, mover el tubo de salida desde el depósito de residuos en un depósito de recogida o alimentar en otro dispositivo para pruebas posteriores.
13. Determinar el tiempo de recogida basada en el número deseado de gotas y la frecuencia de generación calculado.
14. Anotar la fracción de gotas que contienen 0, 1, 2, ..., N partículas para cuantificar la eficiencia utilizando ya sea gota video resultados generación o pipeteando una muestra de emulsión recogieron para su inspección.

4. Los resultados representativos

Los resultados se presentan que lograr tanto una partícula controlado y controlado doble partícula encapsulación (Figura 3). Al reducirla velocidad de flujo del FC-40 aceite en un medio, de una sola partícula de encapsulación se convierte en dos partículas de encapsulación. Por el contrario, se podría haber aumentado la velocidad de flujo acuoso para suministrar partículas a la boquilla de forma más rápida, pero también nos han aumentado el riesgo de inyección de la corriente acuosa. Los histogramas en la Figura 3 se presenta el número fraccionario de partículas por caída de los dos casos, junto con las comparaciones con las estadísticas de Poisson. Las gotas ocasionales con partículas de cero se deben principalmente a "desaparecido" las partículas en los trenes solicitados, mientras que los casos en que hay más partículas encapsuladas que resultado deseado de locales altas concentraciones de partículas y las partículas que a veces emigran hacia una de las dos posiciones verticales de enfoque. Tenga en cuenta que la flotabilidad juego tal como se describe en la Sección 2 no se utilizó. En su lugar, la bomba de jeringa se inclina físicamente para permitir la sedimentación de partículas hacia la salida de la jeringa, que conduce a una alta concentración de partículas durante la carrera.

Figura 4. Sin orden completa, grupos locales de orden y se encapsulan las partículas, pero muchas gotas son sin partículas. Un histograma muestra la disminución de la eficiencia de encapsulación para la encapsulación de partículas deseado dos.

Figura 1. Dispositivo de encapsulación. a) En general el dispositivo con las entradas, salida y el canal de largo el pedido. La altura del dispositivo es de 52 micras y el ancho del canal de pedido es de 27 micras. b) Tanto acuosa y entradas de petróleo tienen filtros grandes escombros con huecos en el orden de la anchura del canal de pedido para la vista ampliada de la entrada de aceite. c) La vista ampliada de la boquilla muestra la misma anchura de canal de 27 m para los canales acuosos y aceite, seguido por la contracción de la boquilla de 22 micras y la expansión súbita a un canal más ancho 61 micras.Tenga en cuenta que las dimensiones del dispositivo que se muestran aquí han sido verificadas mediante un perfilómetro después de la microfabricación y difieren ligeramente de las dimensiones nominales de la máscara. Una verdadera imagen del canal de pedidos y la boquilla están disponibles en línea, como la figura de consulta 1 . El archivo de máscara de AutoCAD también ha sido incluido en línea como un suplemento a este manuscrito.

Figura 2. Histéresis de un goteo de transición chorro usando un dispositivo más amplio (80 micras de ancho x 22 m de altura). a) A velocidad constante FC-40 de flujo (Q _aceite = 45 l / min), la formación de descenso constante se produce a 10 kHz utilizando una solución acuosa de caudal Q _aq = 8 l / min. A medida que la tasa de flujo acuoso se incrementa lentamente a 10 y mu, l / min, chorro de la corriente de fluido acuoso se dispara. b) Cuando el caudal es devuelto a 8 l / min chorro sigue. Tenga en cuenta que la formación de gotas constante puede ser re-establecido por la breve pausa de la bomba de flujo acuoso (una pausa de 1 segundo es típico).

Figura 3. Encapsulación individual o doble-partícula. Una formación de gotas) con una célula por gota (Q _aceite = 60 l / min, Q _aq = 9 l / min) con una tasa de generación de gota de 6,1 kHz, el tamaño promedio de gota 24.4 PL, y una eficiencia de captura de una sola célula D _k = 79,5% y _K p = 83,7% (λ = 0,95) para un tamaño de muestra de n = 517 gotas _d y n _p = 491 partículas. b) la formación de gotas con dos celdas por gota se consigue simplemente mediante la reducción de la FC-40 caudal Q _{de aceite} a 30 μL / min. Los más grandes (39,8 pL) gotas se forman a un ritmo de 3,8 kHz con una eficiencia de captura de dos células D _k = 71,5% y P = _k el 79,5% (λ = 1,80) para un tamaño de muestra de n _d = 383 gotas y n _p = 689 partículas. cd) Dos histogramas de comparar la eficiencia de encapsulación de partículas gota D _k de la encapsulación ordenó una y dos partículas con las estadísticas de Poisson (encapsulado al azar). Nótese que en ambos casos, el espaciamiento de las partículas en la dirección del flujo es de aproximadamente 17-18 micras para totalmente ordenadas, partículas que se alternan. Vídeos complementarios que muestran tanto la encapsulación de uno y dos partículas están disponibles en línea. Haga clic aquí para ver la 3a suplementarios Película . Haga clic aquí para ver la película 3b suplementarios .

Concentración Figura 4. Afecta grandemente la eficiencia de encapsulación. A) A medida que disminuye la concentración, el ordenamiento completo no se produce, y así "agujeros" en los trenes de emerger, dejando unas gotas con menos de partículas previstos. B) El histograma muestra la disminución de la eficiencia ( D _k = 55,9%, p _k = 70,9%) para la encapsulación de dos partículas debido a un menor valor de λ = 1,57 donde hay casi la misma cantidad de una sola partícula cae a medida que hay doble de partículas gotas. Esta cifra es el resultado de _aceite Q = 30 l / min y _aq Q = 9 l / min, las condiciones de flujo mismas para la Figura 3b. Un video suplementario representante está disponible en línea. Haga clic aquí para ver la película de consulta 4 .

Discussion

A pesar de grados relativamente altos de pedidos, no todas las gotas contendrá el número apropiado de partículas o células. Eficiencia de encapsulación puede ser calculada como el número de células o partículas que quedan encapsulados en gotas con la ocupación deseado dividido por su número total. Estos datos en bruto se puede obtener ya sea desde un sistema automatizado de algoritmo de video de alta velocidad o de imágenes de una muestra de emulsión de recogida. Esto puede ser comparado con la fracción de partícula...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
AutoCAD	AutoDesk
Transparencia Máscara	Fineline Imaging Inc.
SU-8 Fotoresinas	MicroChem	2050
Dektak Perfilómetro	Veeco
Petri	BD Falcon	351058
Kit de elastómero de silicona PDMS	Dow Corning Corp.	Sylgard 184, Número de material (240) 4019862
Desecador de vacío	Jencons	250-030
Bomba de vacío	Alcatel Vacuum Technology	2010 C2
Regulador de vacío	Cole-Parmer	EW-00910-10
Horno	Thermo Scientific	Lindberg Blue M, OV800F
Biopsia en sacabocados, 0,75 mm	Harris	Uni-Core 15072
Laboratorio de Tratamiento de corona	Electrotécnica Products Inc.	BD-20AC, SKU 12051A
Las láminas de vidrio	Sello de Oro	3010
Aquapel	PPG Industries		Estrategia Alternativa
Microesferas de poliestireno, 9,9 m	Thermo	G1000
OptiPrep	Sigma-Aldrich	D1556	No se ha demostrado
Jeringas Luer-Lok	BD	1 ml: 309628 3 ml: 309585
FC-40 fluorocarbono aceite	3M Inc.	Sigma Aldrich, F9755
PFPE-PEG fluorotensioactivo	RainDance Tecnologías
Aceite mineral ligero	PTI Productos químicos de proceso	08042-47-5	Estrategia Alternativa
Mineral de surfactante de aceite	Evonik Goldschmidt Corporación	Abil EM 90	Estrategia Alternativa
Tygon tubo de PVC	SmallParts	TGY-010
Calibre 30 Luer-Lok de agujas y jeringas, 1/2 "	SmallParts	NE-301PL-C
Microscopio invertido	Carl Zeiss de imágenes	Axio Observer.Z1
Cámara de alta velocidad	Investigación de la Visión	Phantom V310
Las bombas de jeringa (2)	Chemyx Inc.	Nexus 3000
Aceite de silicona	Dow Corning	200 fluido, 10 cSt	Opcional para el almacenamiento de emulsión