Nanotopology de adhesión celular en ángulo variable total microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM)

Summary

Topología de la adhesión celular sobre un sustrato se mide con una precisión nanométrica de ángulo variable total de microscopía de fluorescencia de reflexión interna (VA-TIRFM).

Abstract

Topología de la superficie, por ejemplo de células que crecen sobre un sustrato, se determina con una precisión nanométrica de ángulo variable total Microscopía de Fluorescencia de Reflexión Interna (VA-TIRFM). Las células se cultivan en portaobjetos transparentes y se incubaron con un marcador fluorescente distribuido homogéneamente en su membrana plasmática. Iluminación se produce mediante un rayo láser paralelo bajo ángulos variables de reflexión interna total (TIR) ​​con diferentes profundidades de penetración del campo electromagnético evanescente. Grabación de imágenes de fluorescencia tras la irradiación en alrededor de 10 diferentes ángulos permite calcular distancias sustrato celular con una precisión de unos pocos nanómetros. Las diferencias de adhesión entre las distintas líneas celulares, por ejemplo células cancerosas y las células malignas, son menos así determinada. Además, los posibles cambios de la adhesión celular a un tratamiento químico o fotodinámica puede ser examinado. En comparación con otros métodos de super-resolución exposición microscopía de luz se mantienedaño muy pequeño, y no de las células vivas se espera que ocurra.

Introduction

Cuando un haz de luz que se propaga a través de un medio de índice de refracción n ₁ cumple una interfaz a un segundo medio de índice de refracción n ₂ 1, la reflexión interna total se produce en todos los ángulos de incidencia Θ, que son mayores que el ángulo crítico _c = Θ arcsen (n ₂ / n _1). A pesar de estar totalmente reflejada del haz de luz incidente evoca un campo electromagnético evanescente que penetra en el segundo medio y decae exponencialmente con la distancia perpendicular z desde la interfaz de acuerdo a I (z) = I _{0 ^{ez / d (Θ).}} I (z) corresponde a la intensidad del....

Protocol

1. Siembra y la incubación de células

1. Se siembran las células individuales, por ejemplo U373-MG o U-251-MG células de glioblastoma a una densidad típica de 100 células / mm ² sobre un portaobjetos de vidrio y crecer para 4872 hr en medio de cultivo (por ejemplo, RPMI 1640 suplementado con 10% suero de ternera fetal y antibióticos), utilizando una incubadora a 37 ° C y 5% CO _2.
2. Se incuban las células con un marcador de membrana, por ejemplo, 6-dodecanoil-2-dimetilamino naftaleno (laurdan) aplicada durante 60 min a una concentración de 8 M (en medio de cultivo) ^4, o un marcador de citoplas....

Discussion

Se describe un método para la medición de distancias en el sustrato de células con una precisión nanométrica. En la actualidad, los métodos de microscopia de super-resolución, por ejemplo, sobre la base de iluminación estructurada ⁷ o en un solo ^8-10 moléculas de detección, así como el agotamiento de la emisión estimulada (STED) microscopía ¹¹ son de considerable interés. Ninguna de estas técnicas, sin embargo, permite una resolución axial por debajo de 50 nm. Además, la irradia.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre	Empresa	Tipo	Comentarios
Incubadora	Nunc	Nunc Cellstar QM1300SVBA
Flujo laminar	Holten Safe	S2010 1.2 EN GG 1LN
DMEM + 10% FCS + 1% de penicilina / estreptomicina	Biochrom		Cultivo medio
Diapositivas de vidrio objeto	Marienfeld	Vidrio blanco puro	Procedimiento de limpieza especial utilizado
6-dodecanoil-2-dimetilamino naftaleno (laurdan)	Molecular Probes		Marcador fluorescente (solución madre: 2 mM en etanol)
Microscopio	Carl Zeiss	Axioplan 1
Láser diodo	PicoQuant	LDH 400 con controlador PDL 800-B	Longitud de onda: 391 nm
Modo simple sistema de fibra	Punto de Origen	kineFlex	Se utiliza con la óptica de colimación
EMCCD cámara	Andor	DV887DC	Cámara trasera iluminada