Aislamiento de ratón Islet Langerhans utilizando una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra

Resumen

Una descripción detallada de ratón aislamiento de islotes se describe utilizando la técnica de canulación en pancreático ductal in situ y la perfusión de una combinación de colagenasa purificada y proteasa neutra.

Resumen

La interrogación de expresión génica de células beta y la función in vitro se ha desplazado en ángulo recto en los años del estudio de líneas celulares de roedores tumorigénicas al estudio de islotes aislados de roedores. Islotes primarias ofrecen la ventaja de que más fielmente refleja la biología de las vías de señalización intracelular y respuestas secretoras. Considerando que el método de aislamiento de islotes usando tejido de disociación de enzimas (TDE) preparaciones ha sido bien establecido en muchos laboratorios de ^1-4, las variaciones en la consistencia de rendimiento y calidad de los islotes de cualquier cepa de roedor dado que limiten el alcance y la viabilidad de los islotes estudios primarios. Estas variaciones ocurren a menudo como resultado de los TDEs crudo parcialmente purificadas utilizadas en el procedimiento de aislamiento de islotes; TDES exhiben frecuentemente de lote a lote variaciones en la actividad y a menudo requieren ajustes en la dosis de enzima utilizada. Un pequeño número de informes han utilizado purificó TDEs para aislamientos de células de roedores ^{5, 6} 7, 8, en el que los TDEs se someten a perfusión directamente en el conducto pancreático de ratones, seguido por fraccionamiento tejido crudo a través un gradiente Histopaque ^9, y el aislamiento de islotes purificados. Una diferencia significativa en nuestro protocolo es el uso de colagenasa purificada (CI zyme MA) y neutral combinación proteasa (CI zyme BP). La colagenasa se ​​caracteriza por el uso de un ⁶ colágeno fluorescencia actividad degradante (CDA) de ensayo que utiliza la etiqueta fluorescente fibrillas solubles en piel de ternera como sustrato ^6. Este sustrato es más predictiva de la cinética de degradación del colágeno en la matriz del tejido ya que depende de colágeno nativo como el sustrato. La proteasa fue characterized con un ensayo fluorescente sensible cinética ^10. Utilizando estos ensayos mejorados junto con el análisis bioquímico más tradicional habilitar el TDE a fabricar más consistente, lo que conduce a un rendimiento mejorado la consistencia entre los lotes. El protocolo descrito en el aquí se ha optimizado para un rendimiento máximo de islotes y morfología de los islotes óptima utilizando ratones C57BL / 6. Durante el desarrollo de este protocolo, varias combinaciones de colagenasa y proteasas neutras se evaluaron a diferentes concentraciones, y la proporción final de colagenasa: proteasa neutra de 35:10 representa el desempeño de enzima comparable a Sigma Tipo XI. Debido a la variabilidad significativa en los rendimientos promedio de los islotes de diferentes cepas de ratas y ratones se ha informado, modificaciones adicionales de la composición TDE debe hacerse para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes se recuperaron de diferentes especies y cepas.

Protocolo

A. Materiales necesarios: Véase la Tabla 1 (reactivos) antes de la preparación

1. HBSS (P / S): 100 ml de HBSS 10X + 900 ml de H ₂ 0 + 1% de penicilina / estreptomicina (almacenado en el refrigerador o se mantuvieron en hielo).
2. 20% stock de BSA se hace en agua y se dividió en alícuotas y se almacenó a -20 ° C.
3. HBSS (BSA): 200 ml 1X HBSS (P / S) + 3 ml de 20% de BSA (concentraciones finales de 0,3% de BSA es)
4. Islet medio: RPMI + 10% de FBS + glutamina 1% + 1% penicilina / estreptomicina
5. Histopaque 1100: 240 ml Histopaque 1119 + 200 ml 1077 Histopaque
6. Sutura 4-0 (McKesson): cortado en 2 ¾ pulgadas piezas y almacenado en una caja de Petri 10 cm
7. Instrumentos: Doble las pinzas de herramientas de la ciencia Artes a 90 °, y limar los dientes de sierra de los tres pares de pinzas. El objetivo es opaco a los dientes, no para eliminarlos.
8. Cánula para la administración de la mezcla de colagenasa / proteasa: 27G ½ pulg aguja, 30 ½ pulgadasaguja, PE50 tubo cortado en piezas de 12 pulgadas. Presentar dos agujas a un final suave y redondeada que no tiene bordes afilados. Insertar la aguja 27G en un extremo de una pieza de 12 pulgadas de tubo de PE50. Retire la aguja 30G de la caja por la rotura de la carcasa con un par de alicates, girando la carcasa de ¼ de vuelta cada vez. Retire la aguja con las pinzas de la carcasa y la inserta en el otro extremo de la tubería PE50 bajo un microscopio de disección. Asegúrese de no doblar la tubería como se inserta la aguja en el tubo PE50. La aguja 27G es el extremo que va a conectar la jeringa de la colagenasa.
9. La colagenasa (CI zyme MA) y Neutral Protease (CI zyme BP). Reconstituir la TDE según instrucciones del fabricante. Consulte el Certificado lote específico de análisis para calcular la concentración de la actividad enzimática. Transferencia de un total de 350.000 colágeno degradantes actividad (CDA) unidades de la colagenasa reconstituido y 100.000 unidades de proteasa neutral de la reconstitbuido Proteasa BP en un tubo cónico y se completa hasta 15 ml en total en HBSS (P / S)

B. Paso a Paso Protocolo

1. La inflación del páncreas con la mezcla colagenasa / Proteasa

1. Eutanasiar ratón por dislocación cervical, saturar el torso ratón con 70% de EtOH, la cavidad abdominal abierta completamente del ano a diafragma con las tijeras de disección y pinzas.
2. Coloque el mouse sobre la plataforma de un microscopio de disección.
3. Tire el ciego y el colon ascendente hacia fuera y puso fuera de la cavidad del cuerpo hacia la izquierda. Véase la Figura 1 para un resumen de los pasos siguientes.
4. Coloque los lóbulos del hígado contra el diafragma, sino que debe permanecer allí si la cavidad corporal es lo suficientemente abierto. Encontrar la arteria hepática, vena portal y el haz del conducto biliar que conduce al hígado agarrando el duodeno con pinzas curvas. Con otro par de pinzas curvas, llegar debajo de la arteria, vena, y bu conductondle y saque un 2 ¾ pulgadas pedazo de sutura 4-0 en la arteria, vena conducto biliar, y lo atan una vez y tire con fuerza tan cerca del hígado como sea posible.
5. Utilizando dos pares de pinzas curvas, cuidadosamente agarrar el duodeno y encontrar el conducto biliar unido al duodeno en la papila. Utilice una tenaza de la pinza para perforar el páncreas y el derecho del tejido conectivo debajo de la estrecha vía biliar a la papila. Mete la pinza rápidamente a través del órgano para hacer un agujero y luego puso las dos pinzas de fórceps medio y coge otro trozo de 2 ¾ pulgadas de sutura 4-0 y atarlo a través de una vez y tire de ella a un pequeño círculo, pero NO tire fuertemente.
6. Cambiar a los 90 ° fórceps y las tijeras Vannas superfinas. Con las pinzas de 90 °, con cuidado apretar y tirar del intestino delgado hasta el conducto biliar es tensa. Hacer un corte horizontal a través de la papila con las tijeras por apuñalamiento las tijeras abiertas en el intestino y después cortando con un solo movimiento. Trate de hacer solo one cortar a través de la papila sin desplazar el conducto de la bilis desde la papila.
7. Mientras mantiene el intestino con los fórceps 90 °, inserte la cánula en el conducto biliar hasta la mitad de la longitud de la vía biliar, a continuación, tire suavemente de la sutura apretada alrededor de la cánula.
8. Llene una jeringa de 3 ml con 2,0 ml de la mezcla de colagenasa / proteasa y se inyecta dentro de la cánula a un ritmo lento y constante.
9. Después de inflación del páncreas, retire la cánula de la vía biliar y el uso de las pinzas curvas y tijeras curvas de primavera para extirpar el páncreas hinchado comenzando en el colon descendente y cortando el tejido conectivo como usted tira los intestinos hacia arriba. Continuar para extirpar el páncreas de los intestinos hasta llegar a la vía biliar, a continuación, retire el páncreas del bazo, el estómago y de las vísceras de la cavidad abdominal. Termine de retirar al cortar lejos las suturas. Añadir el páncreas a un tubo de 50 ml que contiene 5 ml de HBSS(P / S). Este tubo debe ser en hielo.
10. Repetir el procedimiento anterior para cada animal de hasta cuatro animales. Para obtener resultados óptimos, se disocian sólo cuatro pancreata de una sola vez. Por lo general, mientras que los cuatro primeros están en el baño a 37 ° C, inflamos otro pancreata cuatro.

2. Páncreas La disociación

1. Colocar los tubos de 50 ml que contienen la pancreata en un baño a 37 ° C durante 15 min.
2. Agite suavemente el tubo y compruebe que la disociación del tejido, asegúrese de tejido se deshace fácilmente, entonces remolino de los tubos 12 veces mientras que usted está sosteniendo el tubo con la tapa.
3. Añadir no más de 30 ml de HBSS (BSA) (esta puede ser una cantidad menor, dependiendo de cuánto se requiere para equilibrar los tubos para el paso de centrifugación), y se centrifuga a 290 xg durante un minuto.
4. Aspirar el sobrenadante cuidadosamente y dejar una pequeña cantidad de sobrenadante (2-3 ml) en la parte inferior a fin de no perturbar el sedimento celular.
5. Uso de una jeringa de 30 ml attached a 14G aguja, añadir no más de 10 ml de HBSS (BSA) y se aspira la suspensión arriba y hacia abajo 2 veces.
6. Filtrar la mezcla de células a través de un colador de té de plástico en un tubo de 50 ml y enjuague con otro HBSS 10 ml (BSA).
7. Centrifugar a 330 xg durante 2 min.
8. Decantar el sobrenadante e invertir los tubos para drenar en una toalla de papel absorbente durante 1 min.
9. Resuspender cada tubo 10 ml en frío 1100 histopaque.
10. Superponer el histopaque con 10 ml de HBSS (BSA) y se centrifuga a 900 xg durante 18 min.
11. Retire el completo de 20 ml de sobrenadante utilizando un gran taladro 25 ml pipeta y pasar el sobrenadante a través de un filtro invertido 70 micras.
12. Enjuague los islotes en una placa de Petri de 10 cm por 10 medios de comunicación de pipeteo islotes ml a través del filtro mientras la mantiene boca arriba sobre el plato.
13. Cultura los islotes en un 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora de cultivo de tejido hasta que esté listo para la experimentación. Por lo general, los islotes son recogidos a mano y contó antes de experimentation.

3. Los resultados representativos

Los rendimientos de los islotes, la morfología y la calidad son los parámetros generales utilizados para juzgar el éxito de aislamiento de islotes. En nuestras manos, los rendimientos de los islotes a partir de la media de C57BL / 6 mouse están en el intervalo de 150-250 islotes que utilizan este protocolo (véase la Tabla 2), y son comparables con los obtenidos mediante optimizada Sigma tipo XI colagenasa. Sin embargo, los rendimientos pueden variar dependiendo de la cepa de ratón utilizada y la edad del ratón. La mayoría de los animales que utilizamos son en el rango de edad de 8-16 semanas Este protocolo ha sido probado en múltiples cepas de ratón, incluyendo C57BL / 6 (180 a 250 islotes / ratón), CD1 (200-300 islotes / ratón), 129 / B6 (200-300 islotes / ratón), BLKS-db/db (120-200 islotes / ratón), NOD (10 semanas de edad, 100-150 islotes / ratón), y NOD-SCID (100-150 islotes / ratón ). Morfología de los islotes típico se muestra en la Figura 2, en la que los islotes tienen una forma redonda a oblonga con un tamaño relativamente uniforme (aunque el tamaño UNIFormity puede variar de una cepa a otra). La Figura 3 muestra el análisis típico de la glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes aislados de ratón purificados utilizando TDEs vs Sigma colagenasa tipo XI. Típicamente, una alta calidad de los resultados de la preparación de islotes en una estimulación de la insulina a la glucosa 25 mM que es 6-20 veces mayor que la observada en glucosa 2,5 mM. Otras aplicaciones también puede ser utilizado para probar la calidad de los islotes aislados, y éstos incluyen el uso de técnicas de perifusión, Ca ^{2 +} de imágenes (con Fura2), y la transcripción inversa-PCR, entre otros ^11.

Figura 1. Un resumen de la canulación del conducto biliar.

Figura 2. Aspecto típico de islotes C57BL / 6 a las 24 horas aislamiento siguiente. Las imágenes fueron adquiridas en una deverted microscopio con un aumento de 40X.

Figura 3. Glucosa estimulada por la secreción de insulina de ratones C57BL / 6 islotes. En aislamiento hr 24 siguiente, 100 islotes se incubaron en una placa de 12-así durante 1 hora a 37 ° C en solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES solución que contiene 2,5 mM de glucosa. Los islotes se transfirieron entonces a Krebs-Ringer HEPES a 2,5 mM de glucosa por una hora adicional, después de lo cual se recogió el sobrenadante para la medición de la insulina utilizando una de dos sitios inmunoespecífica ligado a enzimas (ELISA) (Crystal Chem). Los islotes mismos posteriormente se transfirieron a solución de Krebs-Ringer tamponada con HEPES que contiene 25 mM de glucosa, y la liberación de insulina en el medio se midió por ELISA después de 1 h de incubación.

Discusión

En este protocolo, hemos descrito nuestro procedimiento para la canulación, la perfusión de colagenasa, y la disociación del páncreas murino, con el objetivo de aislar los islotes de Langerhans. Técnicamente, nuestro método, una vez dominado, debe permitir el aislamiento páncreas dentro de 4 min de la eutanasia al animal, y por 1 hr debe resultar en el aislamiento de islotes de un solo animal. La rapidez de la técnica nos permite aislar islotes de hasta 12 ratones en un estiramiento típica, lo que resulta en el aislamiento de hasta 3.000 islotes.

A diferencia de otros protocolos que utilizan preparaciones crudas de colagenasa, nuestro protocolo incluye el uso de proteasas purificadas, IC del enzima colagenasa MA y CI proteasa enzima BP. Las variaciones en la consistencia de los preparados TDE que están disponibles comercialmente requiere que cada lote se prueba individualmente y optimizado antes de uso general. Esta variabilidad lote a lote que nos llevó a considerar el uso de puriTDE cados de VitaCyte. Estos TDEs altamente purificados se caracterizan por varios métodos incluyendo el uso de ensayos sensibles de fluorescencia sustrato marcado. El ensayo de fluorescencia CDA es más sensible a las diferentes formas moleculares de la colagenasa que tienen diferentes cinéticas en colágeno nativo degradantes. Históricas ensayos de sustrato péptido proporcionar una evaluación incompleta de la colagenasa. Caracterización de colagenasa por múltiples métodos garantiza una mayor actividad de la enzima entre lotes.

Basado en nuestro propio ensayo utilizando una variedad de preparaciones de colagenasa comercialmente disponibles, se encontró que las combinaciones de enzimas purificadas dio reproducibles de lote a lote resultados. Las principales ventajas de usar TDEs altamente purificado y caracterizado rigurosamente en esta solicitud se una vez que la composición de enzima óptima se define, la consistencia del rendimiento de lote a lote está asegurada. Esta consistencia elimina el proceso de trabajo intensivo de capacitación se requiere normalmente muchopara productos de colagenasa crudo o enriquecido. TDEs purificado también permitir modificaciones adicionales de la composición para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes se recuperaron de diferentes cepas de ratón. Reporting composiciones óptimas de enzimas para el aislamiento de islotes a partir de cepas diferentes de ratones pueden ser más eficazmente comunicada. Esto, a su vez, conduce a un uso más productivo de los recursos y una mayor flexibilidad en el diseño experimental.

Hay muchos pasos críticos que pueden afectar el resultado de los aislamientos islote utilizando nuestro protocolo. La primera es la necesidad de lograr una inflación efectiva del páncreas durante la perfusión de la preparación enzimática. Es importante comenzar la inflación con fuerza suave de la jeringa, y aumentar la fuerza como se infla el páncreas. Es útil para mover los intestinos y levantar el páncreas durante el inflado de modo que la colagenasa perfunde el órgano entero. Otro paso importante es la fuerza con la que se mueve el afte tubosr incubación a 37 ° C (paso 2,2). Se ha encontrado que la agitación páncreas duro contra la tapa del tubo provoca la fragmentación de los islotes, pero sin ningún tipo de disociación mecánica en este paso, el rendimiento de los islotes puede caer drásticamente. También es imperativo que durante la etapa de disociación con la jeringa (paso 2,5), una fuerza de nivel medio se aplica durante el movimiento hacia arriba y hacia abajo con el émbolo, lo que asegura la disociación adecuada de tejido antes de la etapa de filtración (2,6), donde muy poco tejido debe ser retenido en el filtro colador de té. Finalmente, el último paso a seguir con atención es la aspiración de todo 20 ml de HISTOPAQUE los islotes fraccionadas. Aunque islotes son típicamente en la interfase del histopaque y HBSS, se ha encontrado que se pierde islotes cuando tratamos de eliminar sólo la interfaz, sino que ahora quitar toda la 20 ml usando una pipeta de calibre grande 25 ml. Hemos añadido la filtración a través del filtro de 70 micras invertido (paso 2,11) para eliminar la necesidad de centrifuge los islotes varias veces para lavar el histopaque.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre de Reactivo	Empresa		Catálogo #
HBSS 10 veces	Life Technologies	14065
RPMI	Fisher Scientific	10-040
BSA	Sigma Aldrich	cualquier
Histopaque 1077	Sigma Aldrich	10771
Histopaque 1119	Sigma Aldrich	11191
Sutura 4-0 100 m rollo	McKesson	451521
14 g contundente extremo de la aguja	Fisher Scientific	14-8216M
Vannas Sciss Superfine	Fisher Scientific	501778
Tijera curva de primavera	Fisher Scientific	14127
Pinzas curvas (2)	Fisher Scientific	15914G
Fórceps curvo (para 90 °)	Herramientas Artes Ciencias	11052-10
27G 1/2 pulgada aguja	Fisher Scientific	305109
30G 1/2 pulgada aguja	Fisher Scientific	305106
PE tubería	Becton Dickinson	427411
La colagenasa MA	Vitacyte, LLC	001-2030
BP proteasa	Vitacyte, LLC	003-1000
3 ml jeringa	Fisher Scientific	309585
30 ml jeringa	Fisher Scientific	309650
70 micras filtro	Fisher Scientific	352350
10 cm 2 Placa de Petri	Fisher Scientific	351005
Colador de té de plástico	Cualquier fuente de cocina
			Tabla 1. Reactivos y Equipos
			Sigma tipo XI (L010M8618) MA (100615) BP (110.329) MA (081104) BP (100.823) MA (091211) BP (101.109) 216 (± 74) 260 (± 45) 157 (± 37) 200 (± 4)
			Tabla 2. Islotes rendimientos promedio (± DE) utilizando diferentes lotes TDE * * Los datos representan los rendimientos medios de islotes procedentes de al menos 10 ratones. Los números de lote entre paréntesis