Fabricación y uso de microarrays microambiente (MEArrays)

Resumen

Un método combinatorio cribado funcional para obtener ideas sobre los impactos de la composición molecular de los microambientes sobre las funciones celulares se describe. El método aprovecha existentes basados ​​en las tecnologías de microarrays para generar matrices de microambientes definidos combinatorias que soportan la adhesión de células y análisis funcional.

Resumen

Las interacciones entre las células y su microambiente circundante tienen consecuencias funcionales para el comportamiento celular. En el nivel de células individuales, distintos microambientes puede imponer diferenciación, migración, proliferación y fenotipos, y en el nivel de los tejidos del microambiente procesos tan complejos como la morfogénesis y la tumorigénesis ^1. No sólo el contenido celular y molecular de las células impacto microambientes dentro, pero también lo hacen la elasticidad ² y ³ de la geometría del tejido. Se define como la suma total de la célula-célula, ECM-, y solubles en interacciones de los factores, además de las características físicas, el microambiente es complejo. Los fenotipos de las células dentro de un tejido son parcialmente debido a su contenido genómico y parcialmente debido a las interacciones combinatorias con el microenviroment. Un reto importante es vincular las combinaciones específicas de componentes microambientales con comportamientos distintivos. ent "> A continuación, presentamos el microambiente de microarrays (MEArray) plataforma de base de células de cribado funcional de las interacciones con los microambientes combinatorias ^4. El método permite el control simultáneo de la composición molecular y el módulo de elasticidad, y combina el uso de microarrays ampliamente disponible y tecnologías micropatterning. pantallas MEArray requieren tan pocos como 10.000 células por matriz, lo que facilita los estudios funcionales de tipos de células raras, tales como células progenitoras adultas. Una limitación de la tecnología es que microambientes enteros de tejido no puede ser completamente recapitulado en MEArrays. Sin embargo, la comparación de los respuestas en el mismo tipo de célula a numerosos microambientes relacionados, por ejemplo combinaciones pareadas de proteínas ECM que caracterizan un tejido dado, se proporciona una visión de cómo los componentes microambientales obtener tejidos específicos de fenotipos funcionales.

MEArrays se puede imprimir utilizando una amplia variedad de gro recombinantefactores wth, citoquinas, y proteínas purificadas ECM, y sus combinaciones. La plataforma está limitada sólo por la disponibilidad de reactivos específicos. MEArrays son susceptibles de tiempo-caducada análisis, pero más a menudo se utilizan para el análisis de punto final de las funciones celulares que son medibles con sondas fluorescentes. Por ejemplo, la síntesis de ADN, la apoptosis, la adquisición de estados diferenciados, o la producción de productos génicos específicos se miden comúnmente. En pocas palabras, el flujo básico de un experimento MEArray es preparar portaobjetos recubiertos con sustratos de impresión y para preparar la placa maestra de proteínas que se van a imprimir. A continuación, las matrices se imprimen con un robot de microarrays, las células se dejan adherir, crecer en cultivo, y luego se fija químicamente al alcanzar el punto final experimental. Ensayos fluorescentes o colorimétrico, con imágenes de microscopios tradicionales o escáneres de microarrays, se utilizan para revelar correspondientes fenotipos moleculares y celulares (Figura 1).

Protocolo

1. Sustratos de impresión Preparación

La decisión de utilizar polidimetilsiloxano (PDMS)-revestida o poliacrilamida (PA)-portaobjetos recubiertos depende de los parámetros importantes del diseño experimental. El módulo elástico de los dos polímeros se puede ajustar para imitar las rigideces de diferentes tejidos mediante la alteración de la relación base / cura de PDMS, y la proporción de acrilamida / bis-acrilamida de PA. PDMS puede imitar más rígidos los tejidos en el intervalo de 1-10MPa (por ejemplo, cartílago, córnea, y las paredes arteriales), y PA puede imitar tejidos más blandos en el intervalo de 100Pa-100kPa (por ejem....

Discusión

El método que aquí se presenta permite MEArray análisis funcionales de las células y las interacciones combinatorias microambiente ^4. Análisis MEArray combina el uso de las tecnologías de micropatterning básicos, biología celular, y los robots de microarrays de impresión y dispositivos de análisis que están disponibles en muchas instalaciones multiusuario. MEArray pantallas son compatibles con la mayoría de tipos de células adherentes, aunque sin suero formulaciones de medios puede ser necesario ajustar en al.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	El número de catálogo	Comentarios (opcional)
Portaobjetos de vidrio 25 mm x 75 mm	VWR	48311-600
Vidrio cubreobjetos (no.1) 24 mm x 50 mm	VWR	48393-241
Placa de tinción (o tarro Coplan)	VWR	25461-003
Placas de Petri (15 cm)	BD Falcon	351058
NaOH (1,0 N)	Sigma-Aldrich	S2567
APES (> 98% (3-aminopropil) trietoxisilano)	Sigma-Aldrich	A3648
Glutaraldehído	Sigma-Aldrich	G7651	50% en agua
APS (> 98% de persulfato de amonio)	SIGMA-Aldrich	A3678	Preparar 10% de solución de trabajo con ddH 2 O
TEMED (N, N, N ', N'-tetrametiletilendiamina)	Sigma-Aldrich	T9281
La acrilamida (40%)	Sigma-Aldrich	A4058
Bis-acrilamida (2% w / v)	Fisher BioReagents	BP1404-250
0,45 micras filtro de jeringa de 4-mm nylon	Nalgene	176-0045
FITC	Sigma-Aldrich	F4274
PDMS (polidimetilsiloxano)	Dow Corning	3097358-1004	Sylgard 184 Elastómero kit a través de Adhesivos Ellsworth
2-cámara de diapositivas	NUNC	177380
Pluronic F108	BASF	30089186
Aquarium sellador	Dow Corning	DAP 00688
Fluormount-G	Southern Biotech	0100-01
Vasos de plástico desechables
Depresores de lengua
Los guantes de nitrilo
Plástico cajas portaobjetos del microscopio
Girar revestidor	WS-400B-6NPP/LITE	Laurell Technologies Corporation
Horno
Placa Digital
384-y placas			Una marca apropiada para el robot microarray
Microarray robot impresión
Fase invertida y microscopio de fluorescencia
Axon microarrays escáneres	Molecular Devices		Existen múltiples configuraciones