Fabricación y Aplicación de Rosa de Bengala-quitosano Films en Tissue Repair Laser

Resumen

Las suturas son generalmente necesarios para reparar el tejido durante los procedimientos quirúrgicos. Sin embargo, su aplicación puede ser problemático, ya que son invasivos y pueden dañar el tejido. Los métodos de fabricación y aplicación de un adhesivo tisular novela se informó aquí. Esta película de adhesivo se activa por láser y no requiere el uso de suturas.

Resumen

Adhesión tisular fotoquímica (PTB) es una técnica de sutura para la reparación de tejidos, que se consigue mediante la aplicación de una solución de rosa de bengala (RB) entre dos bordes de tejido ^1,2. Estos son entonces irradiado por un láser que es absorbida selectivamente por la RB. Las reacciones fotoquímicas resultantes supuestamente reticular las fibras de colágeno en el tejido con una mínima producción de calor ^3. En este informe, RB se ha incorporado en delgadas películas de quitosano para la fabricación de un adhesivo de tejido nuevo que es activado por láser. Las películas adhesivas, basado en quitosano y que contiene ~ 0,1% en peso de RB, se fabrican y se une a intestino de ternero y nervios tibiales de rata por un láser de estado sólido (λ = 532 nm, la fluencia ~ 110 J / cm ^2, tamaño de la mancha ~ 0,5 cm) . Un tensiómetro sola columna, en interfaz con un ordenador personal, se utiliza para probar la resistencia de unión. El RB-quitosano adhesivas bonos firmemente al intestino con una resistencia de 15 ± 6 kPa, (n = 30). La fuerza de adhesión se reduce a 2 yplusmn; 2 kPa (n = 30) cuando el láser no se aplica al adhesivo. La anastomosis de los nervios tibial también se puede realizar sin el uso de suturas. Una novela quitosano adhesivo ha sido fabricado de que los bonos fotoquímicamente al tejido y no requiere suturas.

Protocolo

1. Chitosan adhesiva Preparación

1. El polvo de quitosano es soluble en solución de ácido acético; para la preparación de una solución madre de ácido acético (2% v / v), añadir 10 ml de ácido acético glacial a 490 ml de agua desionizada (DI-H ₂ O).
2. Para la preparación de una solución madre de Rosa de Bengala (RB) (0,01% w / v) en ácido acético, pesan 5 mg de RB en un vial envuelto con papel de aluminio para evitar la fotodecoloración. Añadir 0,5 ml de DI-H ₂ O para disolver el polvo a continuación, añadir 49,5 ml de solución de ácido acético acciones (que se describe en la sección 1.1).
3. Para la preparación de quitosano solución (1,7% w / v), pesan 0,85 g de polvo de quitosano (MW medio, 85% grado de acetilación) y añadir a 50 ml de solución de ácido acético RB. El control se preparó por disolución de quitosán en la solución de ácido acético sin RB.
4. Añadir un agitador magnético a la mezcla de quitosano y se agita a temperatura ambiente. Para asegurar la disolución completa de los componentes, se agita la quitosanaen ácido acético + RB durante dos semanas y el quitosano en ácido acético durante 5 días (control). Cuando quitosano se disuelve, el pH de la solución aumenta desde ~ 2,6 a ~ 3,9. Tenga en cuenta que RB es poco soluble en pH ácido y que requiere un aumento en el pH de la solución y un tiempo prolongado de agitación para disolver.
5. Centrifugar las soluciones a 3270 xg durante 1 hora y se recoge el sobrenadante usando, por ejemplo, una jeringa estéril de 10 ml. Asegúrese de no molestar a la impureza de pellets. Durante este paso, la solución se limpia de impurezas macroscópicas y la materia insoluble.
6. Se inyecta la solución (centrifuga) quitosano en una losa perpex plana utilizando una jeringa estéril. El espesor de la película seca depende de la relación entre la cantidad dispensada de la solución y el área de superficie sobre la que se extiende la solución. Asegúrese de que la solución está libre de burbujas de aire y se extendió uniformemente sobre la losa. Para obtener películas delgadas con un espesor de 13 micras ~, ~ inyectar 1 ml de solución de más de 12 cm ^{2 de} superficieárea (dimensiones 3x4 cm ~, Figura 1A).
7. Cubrir la placa de plexiglás con una pantalla, de lámina de aluminio por ejemplo, para evitar la fotodecoloración de la solución. Asegúrese de que la ventilación de aire suficiente, se garantiza que se seque la solución bajo la pantalla.
8. Agregar la solución se seque a temperatura ambiente (25 ° C) y presión (1 atm) hasta que la película resultante es insoluble en agua y no se hincha macroscópicamente. Esto se consigue típicamente en 2 semanas.
9. Separe las películas cuidadosamente con una espátula delgada y plana: estas películas se pueden despegar fácilmente el bloque de metacrilato sin dañarlos.
10. Medir el espesor de las películas utilizando un micrómetro.
11. Cortar el adhesivo en tiras rectangulares con una tijera afilada y limpia y colocarlos entre las diapositivas de vidrio estériles para preservar su forma plana. Envuelva las diapositivas en papel de aluminio para blindaje de luz y almacenar a temperatura ambiente. Etiquetar los adhesivos con o sin RB como "rosa adhesivo" o "ADHES quitosanoive ", respectivamente.
12. La rosa películas adhesivas se pueden esterilizar utilizando etanol (90%) o con radiación gamma (0,1 kGy / h durante 24 h) ^4,5.

2. Atenuación óptica adhesivo

1. Fije el adhesivo de color de rosa en el interior de una cubeta de cuarzo.
2. Registrar su espectro atenuada en el intervalo de 400 a 800 nm utilizando un espectrofotómetro de doble haz ^4.
3. Suponiendo que la validez de la ley de Beer, el cálculo de la longitud de atenuación del adhesivo de la siguiente manera: I = I ₀ ^e-Ax donde ₀ es la intensidad del haz incidente, 1 / A es la longitud de atenuación, y x es el espesor de la película.
4. Repetir los pasos desde 2,1 hasta 2,3 para el adhesivo de quitosano para servir como un control.

3 En la solicitud de Vitro:. Láser unión del tejido en el intestino

1. Harvest intestino de ternera inmediatamente después de la eutanasia de animales y se almacena a -80 ° C.
2. Antes de su uso, descongelar y el hidrato de tincidencia sumergiéndolo en DI-H ₂ O durante 10 min.
3. Bisecar el tejido en secciones (2 x 1 cm) usando una cuchilla # 10 bajo un microscopio de operaciones (x10). Mantenga la humedad de las secciones usando DI-H ₂ O.
4. Lleve los tocones incisión muy juntos (de extremo a extremo). Limpie el exceso de agua de la superficie con puntas de algodón.
5. Colocar una tira de adhesivo rosa (10 x 6 mm) a través de la incisión en la capa serosa con microforceps asegurando un contacto completo con el intestino (Figura 2).
6. La adherencia del tejido del adhesivo rosa se ​​activa mediante un láser bombeado por diodo de estado sólido, que está acoplado a una fibra óptica multimodo (diámetro del núcleo de 200 micras) ^4.
7. Establecer el nivel de potencia del láser de 180 mW e irradiar el adhesivo para ~ 6 min con un tamaño de punto del haz de ~ 5 mm, utilizando los parámetros listados en la Tabla 1. Terreno irradiar el adhesivo asegurar que cada punto se irradió durante ~ 5 segundos antes de pasar el haz al punto adyacente. Tsu procedimiento garantiza que el haz de láser explora toda la superficie de las varias veces adhesivas.
8. Para evaluar la resistencia de la unión de tejido, una muestra de la abrazadera a un tensiómetro de columna calibrada único (Instron, MA, EE.UU.), utilizando mordazas mecánicas. Mover las empuñaduras en 22 mm / min hasta que los dos muñones de tejido separadas ^4.
9. Coloque un adhesivo de color de rosa en el tejido como se describe en el paso 3.5. No irradiar la muestra y medir la resistencia de la unión de tejido como se describe en el paso 3,8. Este ejemplo sirve como control.

4 En la solicitud Vivo:. Anastomosis del nervio tibial

1. Sedate la rata Wistar con isoflurano / O ₂ mezcla (4% durante la inducción, 2% en adelante) ^5. Inyectar por vía subcutánea Buprenex (0,03 mg / kg) para proporcionar intra-operatoria actividad analgésica y aliviar el dolor o incomodidad posible.
2. El procedimiento quirúrgico siguiente debe realizarse bajo un microscopio de operaciones (x10). Hacer una piel oblicuoincisión de unos 3 cm de largo en la parte dorso-lateral del muslo derecho y exponer el nervio tibial con un enfoque de división de músculo a través de los músculos de los glúteos ^2.
3. Parcialmente diseccionar y cortar la adventicia del nervio tibial utilizando micro-tijeras rectas y absorber el exceso de agua con una gasa estéril o puntas de algodón.
4. Cortar el nervio tibial con micro-tijeras.
5. Posicionar una tira estéril de quitosano (dimensiones 5 x 4 mm) por debajo del nervio tibial utilizando micro-pinza.
6. Aproximado de los muñones del nervio extremo a extremo con micro-pinza sobre la tira adhesiva rosa.
7. La tira se adhiere plenamente a la del nervio que forma un collar, que puede ayudar en la rotación del nervio durante la irradiación con láser de la tira.
8. Activar el adhesivo se elevó con el láser como se describe en los pasos 3,6) y 3,7).
9. Recortar el adhesivo redundante aumentó desde el collar del nervio operado.
10. Cierre los músculos y la piel, con cinco puntos de sutura 3-0 ^5.
11. Estándar postoperatorias procedimientos de recuperación se deben seguir incluyendo la inspección diaria de dehiscencia o formación de pus y la administración de analgésicos, si es necesario.

5. Los resultados representativos

Las películas que se obtienen son de color rosa brillante, fino y tener una superficie lisa (figura 1). Ellos también son flexibles y se puede enrollar en tubos de pequeño diámetro sin lágrimas que causan o cualquier otro daño aparente (Figura 1B). El adhesivo rosa tiene dos picos de absorción a 530 y 562 nm, el láser verde es así fuertemente absorbida por el adhesivo y la longitud de atenuación correspondiente a 532 nm es de ~ 12 m (Figura 3). En contraste, las películas de quitosano sin RB atenúa débilmente el láser (1 / a ~ 162 micras), probablemente debido a la dispersión. Se desprende de la trama espectros que ninguna agregación significativa de RB ocurre en las películas.

La rosa uniones adhesivas firmementeal intestino tras la irradiación con láser (Figura 2) lograr una carga máxima típica en el fracaso de 0,9 ± 0,4 N (n = 30). La fuerza adhesiva se estimó como la carga máxima dividida por el área de la superficie adhesiva, a saber, 15 ± 6 kPa (n = 30). El adhesivo no irradiado rosa unido significativamente menor en el tejido (2 ± 2 kPa, n = 30, prueba t no pareada p <10 ^6). La anastomosis in-vivo del nervio tibial se logró con éxito después de la aplicación y la unión del adhesivo rosa en conjunto con el láser verde. Una semana después de la operación, el nervio operado estaba en la continuidad y la fuerza de reparación fue de 17 ± 9 kPa (n = 10).

Figura 1. A) La solución RB-quitosano es fundido en un plano Perspex losa (espesor de la losa ~ 5 mm). Papel de gráfico se coloca debajo de la losa para facilitar el paso seco de fundición. La f insoluble en aguailm se obtuvieron dos semanas después de la fundición. B) El adhesivo rosa es flexible y puede ser enrollado en un cilindro pequeño.

Figura 2. El adhesivo rosa está unido al intestino de ternera después de la irradiación láser. Irradiación uniforme se aplica sobre el adhesivo RB durante adhesión a tejidos; manchas sin embargo seleccionados se muestran en esta imagen para ilustrar el efecto foto-blanqueamiento del láser sobre el adhesivo.

Figura 3. El espectro de absorción (en unidades arbitrarias) del adhesivo rosa muestra dos picos a 530 y 562 nm. El láser verde (λ = 532 nm) es por lo tanto fuertemente absorbida por el adhesivo durante la exposición al láser. El adhesivo de quitosano sin RB absorbe mal el haz de láser.

	n	Area (mm 2)	Potencia (W)	Tiempo (s)	Fluence (J / cm 2)	I (W / cm 2)	Max Load / Area (kPa)
Adhesivo + Laser	30	60 ± 10	0,18 ± 0,03	365 ± 5	~ 110	0,9 ~	15 ± 1
Adhesivo	30	60 ± 10	NA	NA	NA	NA	2 ± 2

Tabla 1. Legend. n, número de muestra, área, superficie del adhesivo rosa (media ± error máximo); energía, potencia del láser (media ± error máximo); Tiempo, tiempo de irradiación (media ± error máximo); Fluence, fluencia del láser promedio, I, estimado irradiance; máximo de carga / área, carga máxima a fallo del tejido reparado dividido por el área de la superficie adhesiva, (media ± SE).

Discusión

La rosa fabricación adhesivo se basa en un sencillo proceso en seco fundido, aunque la disolución de RB en pH ácido requiere agitación prolongada de la solución de quitosano. Es importante dejar que la solución se seque hasta que se convierte en una película insoluble en agua. Esto sucede cuando el contenido en peso de agua es de ~ 10% en la película seca ^6. Películas insolubles se obtienen normalmente después de 2 semanas en seco de colada en condiciones estándar de temperatura y presión (~ 25 ° C y ~ 1 atm)...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Rosa de Bengala	Sigma-Aldrich	632-69-9
Quitosano (MW medio)	Sigma-Aldrich	10318AJ
Ácido acético glacial	Sigma-Aldrich	08050051	2% v / v en agua DI
Agitador magnético	Heidolph	MR Hei-Mix S
Centrífugo	Beckman Coulter	Allegra X-12R
Espectrofotómetro	Varian	Cary 4000 UV-Visible
Láser	CNI Laser	MGL-532
Micrómetro	Mitutoyo	Serie 227
Microscopio quirúrgico	Zeiss	OPMI