Se describe un método para la determinación cuantitativa, medida en tiempo real de ADN glicosilasa y actividades AP endonucleasas en lisados de células nucleares. El ensayo proporciona tasas de actividad ADN Reparación susceptibles de análisis cinético y es adaptable para la cuantificación de la actividad del ADN en el tejido de reparación y lisados tumorales o con proteínas purificadas.
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Artículo de método
Cuantitativo, análisis en tiempo real de la actividad de reparación por escisión de base en lisados celulares que utilizan la lesión específicos Molecular beacons
En este artículo
Resumen
Resumen
Se describe un método para la determinación cuantitativa en tiempo real, medición de ADN glycosylase y las actividades de AP endonucleasa en lisados de células nucleares con base de reparación por escisión (BER) marcadores moleculares. El substrato (faro) se compone de un desoxioligonucleótido que contiene una lesión sola base con un 6-carboxifluoresceína (6-FAM) resto conjugado con el extremo 5 'y un resto Dabcyl conjugado con el extremo 3' del oligonucleótido. El faro BER molecular es de 43 bases de longitud y la secuencia está diseñado para promover la formación de una estructura de tallo-bucle con 13 nucleótidos en el bucle y 15 pares de bases en el 1,2 vástago. Cuando se pliega en esta configuración, el resto 6-FAM se inactivó por Dabcyl de una manera no-fluorescente a través de Förster Resonancia transferencia de energía (FRET) 3,4. La lesión está posicionado de tal manera que tras la retirada lesión base y escisión hebra el restante 5 oligonucleótido base que contiene la fracción 6-FAM se libera del tallo. Suelte unaª desprendimiento de las extintor (Dabcyl) resulta en un aumento de la fluorescencia que es proporcional al nivel de la reparación del ADN. Mediante la recopilación de varias lecturas de los valores de fluorescencia en tiempo real de evaluación de la actividad de REC es posible. El uso de la norma cuantitativa instrumentos PCR en tiempo real permite el análisis simultáneo de numerosas muestras. El diseño de estas balizas BER moleculares, con una lesión de una sola base, es susceptible de análisis cinéticos, cuantificación y validación de REC inhibidor y es adaptable para la cuantificación de la actividad de reparación de ADN en el tejido y lisados de células tumorales o con proteínas purificadas. El análisis de la actividad de BER en lisados tumorales o tejido aspira utilizando estos marcadores moleculares pueden ser aplicables a las mediciones de biomarcadores funcionales. Además, el análisis de la actividad de REC con las proteínas purificadas con este ensayo cuantitativo proporciona una rápida y de alto rendimiento método para el descubrimiento y la validación de los inhibidores de la BER.
Protocolo
1. Diseño Molecular Beacon
1.1 Diseño y ordenar su marcador molecular
El diseño de su marcador molecular debe considerar lo siguiente:
- Tenemos buenos resultados con oligonucleótidos de ADN 43-mer. El contenido de GC debe ser> 32%. Excluir una base G en el extremo 5 '.
- Solicitud de 6-FAM (6-carboxifluoresceína) conjugación en el extremo 5 'y Dabcyl como un 3' modificación.
- La posición de la lesión en la base debe ser # 6 de los 5 'final.
- La longitud del tallo o dúplex horquilla debe ser un mínimo de 15 pb.
- La longitud del bucle recom....
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Discusión
Hay más de 600 citas con "marcador molecular" el término para la detección y cuantificación de numerosas moléculas y las actividades enzimáticas, incluyendo la actividad helicasa 6, la actividad de ADN polimerasa 7,8, el ADN ligase de la actividad 9, actividad de la telomerasa 10, la actividad del ADN y el ADN fotoliasa 11 / RNA híbridos 12, entre muchos otros. Además de la utilización de marcadores moleculares para la medición de las actividade.......
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Divulgaciones
RWS es un Consultor Científico de Trevigen, Inc. El resto de los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Pittsburgh y los Institutos Nacionales de Salud (NIH) [GM087798; CA148629; ES019498] para RWS. Apoyo para el Fondo para la UPCI Lentiviral fue proporcionada a RWS por la subvención del Cáncer Centro de Soporte de los Institutos Nacionales de Salud [P30 CA047904]. También se prestó apoyo por el Departamento de la Universidad de Pittsburgh de Farmacología y Biología Química de DS. También se prestó apoyo a la CV por la ESTRO.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| Cloruro de Potasio | Pescador | P217-500 | Grado molecular |
| EDTA | Pescador | BP120-500 | |
| Glicerol | Pescador | BP229-1 | Grado molecular |
| TDT | Pescador | BP172-5 | |
| HEPES-solución | Invitrogen | 15630 | |
| HEPES-Sal | Sigma | H4034-500G | |
| Hidróxido de potasio | Sigma | 17-8 | |
| 0.22μM filtro | Nalgene | 167-0020 | |
| Slide-A-Lyzer productos de diálisis | Atravesar | 66373 | MW 7000 |
| Jeringa | Pescador | 309659 | |
| Aguja | Pescador | 305196 | |
| 1,5 ml Tubos microcentrífuga | Pescador | 05-408-129 | Negro |
| 15 ml tubos Falcon | Pescador | 352097 | |
| Kit de extracción de proteínas NucBuster | Calbiochem | 71183 | |
| PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Marcadores moleculares | IDT | ||
| BioRad Protein Assay tinte de reagente de concentrado | BioRad | Cat # 500-0006 |
Referencias
- Mutamba, J. T. XRCC1 and base excision repair balance in response to nitric oxide. DNA Repair (Amst). 10, 1282-1293 (2011).
- Tang, J. B. N-methylpurine DNA glycosylase and DNA polymerase beta modulate BER inhibitor pote....
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Reimpresiones y permisos
