Un ensayo Galvanotaxis por análisis de la cinética precursoras neurales migración celular en un campo aplicado externamente directo Corriente Eléctrica

Resumen

En este protocolo, se muestran cómo construir cámaras personalizados que permitan la aplicación de un campo eléctrico de corriente directa para activar el tiempo de imágenes a intervalos de cerebro adulto derivado translocación célula precursora neural durante galvanotaxia.

Resumen

El descubrimiento de células madre neurales y células progenitoras (colectivamente denominadas células precursoras neurales) (CPN) en el cerebro adulto de mamíferos ha conducido a un cuerpo de la investigación dirigida a la utilización de las propiedades multipotentes y proliferativa de estas células para el desarrollo de estrategias neuroregenerativas. Un paso crítico para el éxito de tales estrategias es la movilización de NPCs hacia un sitio de la lesión después de un trasplante exógeno o para aumentar la respuesta de los precursores endógenos que se encuentran en la región periventricular del SNC. Por consiguiente, es esencial para comprender los mecanismos que promueven, orientar y mejorar la migración NPC. Nuestro trabajo se centra en la utilización de los campos eléctricos de corriente directa (dcEFs) promover y migración NPC directa - un fenómeno conocido como galvanotaxia. Endógenos campos eléctricos funcionan como señales fisiológicas esenciales para la migración celular durante el desarrollo normal y la reparación de heridas. Interrupción farmacológica de latrans-neural en embriones de potencial tubo axolotl provoca graves malformaciones en el desarrollo ^1. En el contexto de la cicatrización de heridas, la tasa de reparación de córnea heridos se correlaciona directamente con la magnitud del potencial de heridas epiteliales que surge después de la lesión, como se muestra por la mejora farmacológica o la interrupción de este dcEF ^2-3. Hemos demostrado que los adultos NPCs subependimales someterse a migración catódica rápida y dirigida in vitro cuando se exponen a un dcEF aplicada externamente. En este protocolo se describen técnicas de nuestro laboratorio para la creación de un ensayo de galvanotaxia simple y eficaz para la alta resolución, observación a largo plazo de la translocación dirigida cuerpo celular (migración) en un nivel de una sola célula. Este ensayo sería adecuado para la investigación de los mecanismos que regulan la transducción de dcEF en la motilidad celular mediante el uso de ratones transgénicos o knockout, ARN corto de interferencia, o agonistas / antagonistas de receptores específicos.

Protocolo

Todos los procedimientos que impliquen la manipulación de animales fueron aprobados por la Universidad de Toronto Comité de Cuidado de Animales de acuerdo con las directrices institucionales (Protocolo n º. 20009387). Los siguientes métodos se debe realizar utilizando instrumentos estériles y técnicas, en una campana de flujo laminar en su caso.

En el texto siguiente protocolo, la frase "EFH-SFM" se refiere a medio libre de suero suplementado con factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento de fibroblastos básico y la heparina. EFH-SFM se utiliza en la investigación de la galvanotaxia de NPCs no diferenciados debido a que estos....

Resultados

Análisis cinemático revela que en presencia de un 250 mV / mm dcEF, NPCs indiferenciadas exponer galvanotaxia altamente dirigidos y rápido hacia el cátodo (Figura 5A, Película 1). En ausencia de un dcEF, movimiento al azar de las células se observó (Figura 5B, Película 2). En esta intensidad de campo,> 98% de NPCs indiferenciadas migrar para toda 6-8 hr para los que se explora, y ya que las células muertas no migran esto sugiere que permanecen viables durante este período en la ausen.......

Discusión

Este protocolo ha sido adaptado de los métodos bien establecidos de estudios previos ^7-9. Galvanotactic cámaras pueden construirse utilizando una variedad de técnicas diferentes, incluyendo la construcción de un vaso separado bien para el confinamiento de la siembra de células, o el uso de CO ₂ ablación con láser para la microfabricación de la depresión central ^10,11. Algunas técnicas pueden ser más laborioso o costosos que otros. Se ha descrito un ensayo simple y rentable para la constr.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del elemento	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
			Precursoras neurales de aislamiento de células
2 M NaCl	Sigma	S5886	11,688 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
1 M KCl	Sigma	P5405	7,456 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
1 M MgCl 2	Sigma	M2393	20,33 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
155 mM NaHCO 3	Sigma	S5761	1,302 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
La glucosa 0,5 M	Sigma	G6152	9,01 g disueltos en 100ml dH 2 O
108 mM CaCl 2	Sigma	C7902	1,59 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15070
Tripsina de páncreas bovino	Sigma	T1005
Ovejas testículos hialuronidasa	Sigma	H6254
Ácido quinurénico	Sigma	K3375
Inhibidor de tripsina de ovomucoide	Worthington	LS003086
DMEM	Invitrogen	12100046
F12	Invitrogen	21700075
30% de glucosa	Sigma	G6152
7,5% NaHCO 3	Sigma	S5761
HEPES 1 M	Sigma	H3375	23,83 g disueltos en 100 ml de dH 2 O
L-glutamina	Gibco	25030
FEAG	Invitrogen	PMG8041	Reconstituir en 1 ml de mezcla de la hormona y la alícuota en 20 unidades mu l.
FGF	Invitrogen	PHG0226	Reconstituir en 0,5 ml de mezcla de la hormona y la alícuota en 20 unidades mu l.
La heparina	Sigma	H3149
Apo-transferrina	R & D Systems	3188-AT	0,1 g disueltos en 4 ml de dH 2 0
Putrescina	Sigma	P7505	Disolver 9,61 mg en Apo-transferrina asíción
Insulina	Sigma	I5500	Disolver 25 mg en 0,5 ml de HCl 0,1 N y añade a 3,5 ml de dH 2 0
Selenio	Sigma	S9133
Progesterona	Sigma	P6149
Herramientas generales Dissection	Herramientas Artes Ciencias
Disección microscopio	Zeiss	Stemi 2000
			Galvanotaxis cámara de preparación
Square portaobjetos de vidrio cubierta	VWR	16004
Ácido clorhídrico 6N	VWR	BDH3204-1
Grasa de alto vacío	Dow Corning
60 mm Placas de Petri	Fisher Scientific	0875713A
Poli-L-lisina	Sigma	P4707
Matrigel	BD Biosciences	354234	Descongelar y alícuota en 150 unidades mu l
FBS	Invitrogen	10082139	Utilice únicamente si la inducción de diferenciación NPC, de lo contrario usar SFM + EFH medios de cultivo como se ha indicado anteriormente
Contando microscopio	Olimpo	CKX41
			Vivo Celular Time-lapse de imágenes
Alambre de plata	Alfa Aesar	11434
UltraPure agarosa	Invitrogen	15510-027
Calentar la inactividadATED FBS	Sigma	16140071
Tubería de PVC	Fisher Scientific	80000006	3/32 "ID x 5/32" OD
Blanqueador	Clorox
10 cc jeringa	BD	309604
Calibre 18 aguja	BD	305195
Dremel taladro	Dremel	Modelo 750
Microscopio invertido equipado con cámara de humidificado, incubados	Zeiss	Axiovert-200M
			Recetas Artículo Volumen 2 M NaCl 6,2 ml 1 M KCl 0,5 ml 1 M MgCl 2 0,32 ml 155mm NaHCO 3 16,9 ml La glucosa 1M 1 ml 108 mM CaCl 2 0,09256 ml Penicilina-estreptomicina 1 ml Agua autoclave 74 ml Líquido cefalorraquídeo artificial Artículo Volumen o Masa Líquido cefalorraquídeo artificial 30 ml Tripsina de páncreas bovino 40 mg Ovejas testículos hialuronidasa 22,8 mg Ácido quinurénico 5 mg solución de tripsina Artículo Volumen o Masa SFM 15 ml Inhibidor de tripsina de ovomucoide 10 mg Solución de inhibidor de tripsina Artículo Volumen Agua autoclave 37 ml 10 veces DMEM/F12 10 ml 30% de glucosa 2 ml 7,5% NaHCO 3 1,5 ml HEPES 1 M 0,5 ml Transferrina, putrescina solución 4 ml 25 mg solución de insulina 4 ml Selenio 100 y mu; L Progesterona 100 l Hormona Mix (100 ml en total, almacenan a -20 ° C) Artículo Volumen Agua autoclave 37,5 ml 10X DMEM/F12 (3:1) 5 ml 30% de glucosa 1 ml 7,5% NaHCO 3 0,75 ml HEPES 1 M 0,25 ml Hormona de mezcla 5 ml L-glutamina 0,5 ml Penicilina-estreptomicina 0,5 ml Serum Free Media EFH-SFM: añadir 10 l de EGF, 10 l de FGF, y 3,66 l de heparina FBS-SFM: añadir 0,5 ml de FBS Artículo Volumen Matrigel 150 l SFM 3,6 ml Matrigel Solución alícuota Matrigel debe ser colocado en una caja de hielo y se dejó descongelar lentamente durante 4-5 horas para formar un líquido viscoso antes de mezclar con SFM. Esto asegurará la formación de una capa lisa de sustrato Matrigel. Si no descongelaron lentamente, el sustrato resultante contendrá grupos de Matrigel, posiblemente obstaculizar la migración celular. Artículo Volumen o Masa UltraPure agarosa 300 mg en 10 ml ddH 2 0 SFM FBS inactivado por calor 8 ml 2 ml MatrigelSolución Mezcle 8 ml de SFM con 2 ml de FBS inactivado por calor en un tubo de 15 cc halcón. Mezcla de agarosa con 10 ml ddH 2 0 en un matraz Erlenmeyer, y el calor en un horno de microondas durante 30 segundos en intervalos de 10-sec, asegurando para eliminar la solución del microondas después de cada intervalo de 10-sec y mezclar bien. Tras el final de 10 segundos período de microondas, mezclar la solución de agarosa con el SFM / solución de SFB y guárdelo en un baño de agua 57 ° C.