Respuestas imágenes de calcio en las neuronas GFP-etiquetados de hipotalámicas rodajas de cerebro de ratón

1. Preparación de la solución y gel de agarosa

1. Preparar la solución extracelular de acuerdo con la tabla con agua doblemente destilada. El pH se ~ 7,3 después de 10 minutos de aireación con carbógeno (95% O _2/5% CO _2), la osmolaridad de 300 mOsm ^8. Si una osmolaridad superior se requiere, se puede ajustar mediante la adición de más glucosa (1 mm es igual a 1 mOsm). La solución se filtró dos veces usando un filtro de 0,2 micras membrana para eliminar partículas de polvo y posibles contaminaciones bacterianas.

*N, N-bis (2-hidroxietil)-2-aminoethansulfonic ácido

2. La solución se almacena a 4 ° C, pero debe ser aireado con carbógeno (95% O _2/5% CO ₂₎ durante 10 min antes de su uso.
3. En este momento, preparar también 1 cm ³ bloques de gel de agar para estabilizar el cerebro durante el procedimiento de corte (ver paso 3). En primer lugar, se disuelven 4% (w / v) de agar (Sigma) en agua doblemente destilada, calentando la solución a aproximadamente 60 ° C. La solución calentada disolvió agar se vierte en una placa Petri cuadrada a una altura de 1 cm. Después de enfriamiento y endurecimiento, el gel de agar al 4% se corta en bloques de 1 cm ^3. Estos bloques se pueden almacenar durante hasta 4 semanas a 4 ° C.

2. La disección del cerebro de ratón

Por favor, asegúrese de que todos los procedimientos experimentales con animales se realizan de acuerdo con las directrices establecidas por los comités de bienestar de los animales de las respectivas instituciones.

1. Antes de sacrificing el animal, asegurarse de que los bloques de gel de agar están listos para su uso.
2. Se anestesia el ratón con isoflurano (1-4% de isoflurano en oxígeno usando un vaporizador de precisión durante aproximadamente 1 min). Es importante para prevenir el daño neuronal y por lo tanto la hipoxia. Una desventaja de isoflurano es el costo y la logística de utilizar vaporizadores de precisión. Una sobredosis fatal en un sistema abierto puede ser una alternativa, ya que el ratón se sacrifica. La seguridad es en este caso un problema grave. El isoflurano se debe ventilarse directamente fuera de la habitación. Por lo tanto, una sobredosis en un sistema abierto se debe realizar en una campana química.
3. Eutanasia a los ratones por decapitación después de monitorización de la profundidad de la anestesia por probar el reflejo del pie trasero. Este reflejo del pellizco pedal o de la pata se realiza por firmemente apretando una pata o dedo del pie entre los dedos para provocar una respuesta de retirada por el animal. Un animal que muestra un reflejo no está a un nivel quirúrgico de anestesia y definitivamente no enun estado para practicar la eutanasia.
4. Después de la decapitación, cortar el cuero cabelludo con una hoja de afeitar de un solo filo centralmente en dirección sagital, desde el hueso frontal hasta la protuberancia occipital externa. Mover las dos partes del cuero cabelludo, primero desde el extremo medial caudal en dirección lateral rostral, a continuación, hacia abajo en dirección ventral (Figura 1A-C).
5. Hacer dos laterales y un corte rostral en el foramen magnum con una tijera pequeño resorte (ver, por la dirección de corte de las flechas negras discontinuas en la Figura 1C). Cuidadosamente escindir el cráneo de mediocaudal a rostral lateral con fórceps romos (véase amplios flechas grises en la Figura 1C). En los animales mayores de un pequeño corte en la sutura sagital es útil y necesario a menudo para evitar dañar las capas corticales del cerebro.
6. En este momento los huesos interparietal occipital, parietal y debe ser separada. Si todavía está presente, la duramadre se eliminará cuidadosamente usando pinzas para evitar daños a la BRain en la siguiente etapa.
7. Si quitamos el hueso escamoso, el agujero etmoidal anterior y frontal (Figura 1D).
8. El cerebro ahora pueden eliminar fácilmente usando una espátula de cuchara invertida micro y cortar los nervios craneales (Figura 1E).

3. Rebanar Coronal secciones del hipotálamo del cerebro del ratón

1. Coloque el cerebro en su lado ventral sobre una superficie resistente al corte y eliminar el cerebelo con una cuchilla de afeitar de un solo filo (Figura 2A). Esta superficie de corte recta será la base para el montaje del cerebro en una placa para permitir cortar secciones de cerebro coronal.
2. Pegamento el cerebro con la sección de corte sobre la placa base del microtomo (Zeiss, Hyrax V50) usando cantidades bajas de un curado rápido de alto rendimiento adhesivo de cianoacrilato pegamento (Loctite 406, Figura 1A). Además, un pegamento 1 cm ³ bloque de gel de agar (ver 1,5) en el lado ventral del cerebro (ver 'v' en (Figura 2B).
3. Después de unos segundos, el vínculo se ha secado, coloque la placa en el baño de su microtomo lleno de 6 ° C frío oxigenada (95% O _2/5% CO ₂₎ solución extracelular (ver 1.1).
4. El uso apropiado de baja velocidad rebanar y cortar rodajas gruesas 300 micras. En el caso de nuestro microtomo, se utiliza una frecuencia de 60 Hz, una amplitud de 0,8 mm y una velocidad de 0,8 mm / s (Figura 2C). Las rebanadas coronales del cerebro se recogieron directamente o bien después de cada corte o se puede dejar en el baño hasta que todo el cerebro se ha seccionado. Los cortes de cerebro coronales son cuidadosamente Taxisrred a un vaso de precipitados con una disolución fría extracelular oxigenada. Diversas herramientas se han diseñado para realizar la transferencia (por ejemplo plástico de corte amplio o pipetas Pasteur de vidrio o espátulas grandes cuchara). Depende del experimentador que está siendo preferido. Lo más importante, las rebanadas deben ser manejadas apropiadamente para minimizar el daño.
5. Si el microtomo se puede programar para cortar lonchas de forma automática, usted puede comenzar a preparar el Ca ^{2 +} colorante indicador solución de carga en este momento. De lo contrario, se recomienda que la preparación de esta solución se lleva a cabo antes de que el cerebro ha terminado el corte en lonchas de minimizar los retrasos para medir las respuestas de Ca ^{2 +} en las neuronas, es decir, antes de iniciar el paso 2.

4. Preparación de la solución indicadora de Ca ^{2 +} colorante de carga

Un paso crítico en las neuronas de carga sigue siendo a menudo la salud de las células, que depende de la cantidad de daño inducido por el y la velocidad deel procedimiento de disección. Otra etapa esencial parece ser el uso de Pluronic F-127 fresco solución (ver 4,1). Se está recomendado para hacer esta solución en el laboratorio y no utilizar una solución prefabricada de un proveedor. Dependiendo de la temperatura, la humedad y el tiempo de vida útil de la Pluronic F-127 solución, se observó degradación de las neuronas olfativas y el cerebro durante el Ca ^{2 +} loading procedimiento.

1. Preparar el Pluronic 20% (w / v) F-127 (Sigma) en sulfóxido de dimetilo (DMSO) añadiendo el Pluronic F-127 en polvo en la parte superior de la solución de DMSO. Directamente sonicar esta solución sin vórtice antes de la mezcla. Dentro de sonicación min 2 el Pluronic F-127 se disolvió. 100 l de Pluronic F-127 se preparan soluciones semanal fresco.
2. Tome un tubo de 50 g de células permeables fura-red/AM (Invitrogen, AM, éster acetoximetil) y añadir 5 l 20% de Pluronic F-127 solución. Mezclar la solución con la punta de la pipeta.
3. Añadir 45 l soluti extracelularen (ver 1.1) a la mezcla y agitar brevemente.
4. Añadir un adicional de 325 l solución extracelular y sonicar el tubo durante 3 min.
5. Después de ultrasonidos añadir 1,156 ml oxigenada (95% O _2/5% CO ₂₎ solución extracelular para obtener su último Ca ^{2 +} indicador solución de tinte de carga (30 mM fura-red/AM, 0,33% de DMSO y 0,065% de Pluronic F-127) . Almacenar el tubo en un lugar oscuro hasta su uso (ver 4,8).
6. Transferir las rebanadas de cerebro coronal a una placa de cultivo celular de 6 pocillos (BD Falcon) lleno con oxigenada (95% O _2/5% CO ₂₎ solución extracelular (hasta seis rebanadas por pocillo).
7. Chupe de la solución oxigenada extracelular de las cámaras de la 6-así placa con cuidado de no dañar las rodajas de cerebro.
8. Pipetear directamente 750 l de la solución de Ca ^{2 +} indicador de carga de colorante a cada pocillo. Las rebanadas del cerebro deben estar cubiertos por la solución que contiene fura-red/AM (carga de inmersión).
9. Incue las rodajas en un O ₂ / CO ₂ incubadora de cultivo celular (O _2: 23,5%; CO _2: 5%) durante 45 a 60 min a 37 º C.
10. Al final del tiempo de incubación, reemplazar el Ca ^{2 +} colorante indicador solución de carga fresca por solución oxigenada extracelular para evitar la sobrecarga de las células con fura-rojo e influir de una manera sutil el Ca ^{2 + a} través de la medición de la acción quelante del colorante. Los cortes son luego se mantiene en el O ₂ / CO ₂ incubadora (véase el punto anterior para la configuración) hasta su uso y son viables para un máximo de 3-6 horas.

5. Microscopía y análisis

En este protocolo, la intensidad de la fluorescencia de GFP, que identifica la célula de interés, y de la Ca ^{2 +} colorante indicador se midió simultáneamente en rodajas de cerebro. Por lo tanto, el microscopio confocal debe estar equipado con el láser correcta, filtros y dos tubos fotomultiplicadores para recoger los dos emissien las señales. GFP y el cambio en la intensidad de fluorescencia de fura-rojo se puede medir usando una longitud de onda de excitación única de 488 nm. La emisión de fluorescencia de los fluoróforos pueden ser recolectados usando un filtro 522/DF35 nm para GFP y un filtro de paso largo para longitudes de onda superiores a 600 nm para fura-rojo.

1. Para empezar a monitorizar inducidos estímulo-cambios en la señal de fluorescencia, que son una medida de la concentración intracelular de Ca ^{2 +,} una de las secciones de cerebro fura-rojo cargado se transfiere a una cámara de registro (es decir, Warner Instruments RC-27 cámara de baño abierto) que se puede montar en la configuración de microscopio confocal (Figura 3A, B).
2. Asegure el corte de cerebro con un arpa (Figura 3C) para evitar la rebanada de moverse debido a la velocidad de perfusión de la solución de baño (solución extracelular oxigenada; ver paso 1,1). El arpa (soporte de rebanada) está hecho de una matriz paralela de hilos de nylon (separados uno de otro por ~ 1 mm) ensartadas enuna de plata en forma de U o en un marco de platino. La temperatura de la solución del baño en esta etapa debería ser al menos la temperatura ambiente. Si se requieren temperaturas más altas, la atención adecuada tiene que tener cuidado para evitar la condensación en las lentes del microscopio y el movimiento del plano de foco debido al desplazamiento de piezas en el microscopio.
3. Perfundir la rebanada por 10 min con una solución oxigenada extracelular para eliminar cualquier excedente de extracelular Ca ^{2 +} colorante indicador. El caudal de la perfusión se debe ajustar a ~ 100 (consejos con respecto a un sistema de perfusión adecuado ver ⁹⁾ mu l / s.
4. Mira la rebanada a través del microscopio a bajo aumento, tome nota de la orientación de la rebanada para sus archivos y encontrar su área de interés en el sector, en nuestro caso el área hipotálamo en el cerebro.
5. Cambiar a alta magnificación y encuentra la célula de interés en el corte mediante la recopilación de imágenes GFP y simultáneamente el control de la intensidad de fluorescencia de la fura-rojoseñal (Figura 4A-C). Las células cerca de la superficie podría ser dañado o muerto. Por lo tanto, las células situadas a una profundidad de más de 10 micras debe ser seleccionado para formación de imágenes. De manera fiable podría medir las células hasta una profundidad de 40-50 micras, tras lo cual la fuerza de la señal empezó a disminuir. Recuerde que la señal de fura-red de células en reposo con una baja concentración de Ca ^{2 +} tienen intensidad de fluorescencia relativa alta. Esta alta intensidad de fluorescencia es en este caso no es una señal de las células muertas. La señal de GFP se puede utilizar para detectar cualquier desviación o movimiento de la lámina de tejido o como un indicador de los cambios en el pH intracelular ^10.
6. Ajustar la potencia del láser a un valor que permite mediciones en el cambio de rojo fura-intensidad de fluorescencia y evita la decoloración de los dos fluoróforos. Por lo tanto, comenzar con el nivel mínimo de potencia de láser y ajustar para obtener una suficiente relación señal-ruido mediante el cambio de nivel de negro (offset), abertura del detector, la ganancia y filtro de densidad neutral lásers. A excepción de la potencia del láser, lo mismo debe hacerse para la señal de las buenas prácticas agrarias.
7. Empieza a adquirir imágenes a velocidades entre 0,5 - 2 Hz para recoger el fura-rojo y las señales de las buenas prácticas agrarias. La tasa de adquisición debe ser optimizado para la tasa esperada de la Ca ^{2 +} señales. Voltaje-dependiente de Ca ^{2 +} picos transitorios pueden causar más rápidas y más cortas que la activación de algunas cascadas de transducción de señales que requieran la intervención de varios segundos mensajeros. La longitud de la adquisición de la imagen debe ser apropiado para el propósito del experimento. La señal de GFP con el tiempo ayudará a determinar si cualquier movimiento de la rebanada del cerebro se ha producido.
8. Durante la adquisición y el experimento, todos los ajustes de la cabeza de exploración tiene que mantenerse constante para registrar los resultados confiables que puedan ser comparados.
9. Los cambios en la fluorescencia con el tiempo se pueden analizar usando diferentes programas matemáticos, es decir ImageJ (NIH, Bethesda, MD; http:/ / Rsb.info.nih.gov / ij /), Igor Pro (Wavemetrics) o Matlab (The MathWorks). Por rodea la somata de un GFP-etiquetados neurona que indica la región de interés (ROI), esta misma región exacta puede ser analizado por cambios en Ca ^{2 +} usando la señal de rojo fura-fluorescencia con el tiempo.

Ca ^{2 +} señales pueden ser presentadas como unidades arbitrarias de fluorescencia o como valores (Df / F) de la variación relativa de la intensidad de fluorescencia (Df) normalizaron a la fluorescencia de referencia (F). Este procedimiento resulta en una desviación negativa cuando la intracelular de Ca ^{2 +} aumenta la concentración con fura-rojo como el Ca ^{2 +} colorante indicador. Para facilitar la interpretación de los resultados, se recomienda multiplicar los valores Df / F con -1 para obtener señales positivas de fluorescencia para mostrar un aumento de Ca ^{2 +} (Figura 4C).

Para comparar los resultados entre las neuronas de la amplitud y la frecuencia de la Ca 2 + señales no ocurren con un periodo regular o amplitudes comparables. Algunas señales pueden estar fuertemente influenciada por procesos estocásticos dentro de la célula. Por lo tanto, para cuantificar el cambio total de Ca ^{2 +} en una célula dada y para permitir la comparación de Ca ^{2 +} respuestas entre las neuronas en diferentes regiones del cerebro, el análisis de la área bajo la curva-(AUC) es más apropiado. Esta medida de la cantidad de Ca ^{2 +} abarca cualquier inicial de Ca ^{2 +} transitorios, las fases segunda y sostenida elevación de Ca ^{2 +} respuestas y oscilaciones. En este caso, la atención se debe tomar para analizar el mismo período de tiempo para permitir la comparación entre las neuronas.

6. Los resultados representativos

Para iniciar la caracterización del receptor de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHR) expresar las neuronas del hipotálamo hemos hecho uso de ratones transgénicos que expresan GFP después mediada por Cre excisión en GnRHR neuronas que expresan ^4,11. GFP neuronas fluorescentes fueron identificados en varias zonas del cerebro, incluyendo el hipotálamo. Para investigar las propiedades fisiológicas de estas neuronas GnRHR, que primero registra Ca ^{2 +} señales en rodajas del hipotálamo usando un microscopio confocal. En primer lugar, se obtuvieron cortes coronales de cerebro de estos ratones usando el protocolo descrito anteriormente. Figura 1 ilustra las herramientas necesarias material, y los pasos para la escisión de un cerebro de ratón. Los cortes coronales del hipotálamo del cerebro se redujeron (Figura 2) y luego se cargan de acuerdo con los pasos descritos en el punto 4 del protocolo. Cortes de cerebro individual del área adecuada se colocan en una cámara de registro, se fija con un arpa (figura 3) y, a continuación imágenes utilizando un microscopio confocal (ver los pasos 5.1 a 5.9). Figura 4 muestra un ejemplo de dos rebanadas individuales cerebro coronal identificación único GnRHR-τGFP cuerpos de las células, la fluorescencia en reposo después de loading el corte de cerebro con fura-red/AM y la imagen resultante de la concentración confocal indica que la neurona GFP habían tomado fura-rojo suficientemente para permitir la investigación de los estímulos inducidos por Ca ^{2 +} señales en estas células. Usando el protocolo, se probó inicialmente si las neuronas GnRHR utilizar similares Ca ^{2 +} señales de detección de los estímulos en las diferentes áreas del hipotálamo en respuesta a la activación directa con GnRH (4E Figura). Sin embargo, estas señales difieren en su forma de onda en función de fuerza del estímulo y ⁴ área del cerebro. Para cuantificar el cambio en la dinámica de la Ca ^{2 +} respuestas, el área bajo la curva-(AUC) se puede calcular como una medida del aumento de la concentración intracelular de Ca ^{2 +} (Figura 4E) ^4. Hay estudios en curso para investigar las bases moleculares de la Ca ^{2 +} oscilaciones y ondas, su dependencia en el sexo y el estado hormonal de los animales, y si pueden ser moduladospor otros estímulos naturales.

Figura 1. Herramientas, materiales y pasos para extirpar un cerebro de ratón. A. Herramientas y materiales utilizados para la disección del cerebro: 1, Loctite 406 pegamento extrafuerte, 2 cuchara, espátula micro, 3, hoja de afeitar solo borde, 4, tijeras de primavera pequeñas y medianas, 5, pinzas romas, 6, 7, tijeras, plato de Petri con agar gel bloque, 8, placa base para el cerebro de montaje en micrótomo. BF. Imágenes de algunos pasos que se describen en el punto 2 del protocolo. B. La fotografía de una cabeza de ratón que indica la posición de corte del cuero cabelludo (línea roja) y flechas (naranja) que indican la dirección debe ser la piel se separó de los huesos (ver paso 2.4). C. fotografía de la cabeza del ratón después de la piel se separa muestra las estructuras óseas (ver paso 2,4). Dirección de corte de la tijera y la dirección para romper el cráneo abierto con las pinzas romas se indica ya sea con el negroflechas o trazos grises flechas anchas, respectivamente. D. Fotografía del cerebro de ratón después de la eliminación de las diversas estructuras óseas (ver paso 2,5 - 2,7). Fotografía E. de la extracción del cerebro todavía conectado al cráneo a través de los nervios craneales. F. La fotografía de un cerebro de ratón relativamente indemne.

Figura 2. Cortar secciones coronales del hipotálamo del cerebro del ratón. A. Fotografiar que indica la posición de la cuchilla de afeitar de un solo filo para eliminar el cerebelo (ver paso 3,1). B. Posición del bloque de agar gel en relación con el cerebro pegado sobre la placa de base del microtomo (ver paso 3,2). C. corte de la rebanada del cerebro coronal (nótese aquí la ubicación de cerebro y posiciones de gel de bloque en lo que respecta a la cuchilla de corte de la microtomo; ver paso 3,4.). d, dorsal, v, ventral.

Figura 4. Ca ^{2 +} señales en las neuronas τGFP de rodajas de cerebro de ratón hipotalámicas. AD. Identificación de una neurona GFP y adquisición simultánea de la fluorescencia de fura-rojo en rodajas coronales de cerebro de ratón. A. Confocal imagen de una sección coronal del cerebro identificar GnRHR-τGFP neuronas (verde). B. señal de fluorescencia relativamente uniforme (rojo) de la zona del cerebro se muestra en A observado después de cargar el corte de cerebro con fura-red/AM. C. Fusionada imagen que muestra la neuRon se muestra en una carga con el Ca ^{2 +} colorante indicador (amarillento). Límites de GFP neurona somata se indican en líneas discontinuas blancas, mientras que ejemplos de dos no-GFP somata (flechas) se indican en líneas grises. D. Ejemplo de un GFP y GFP neurona no con mayores cantidades de fluorescencia de color rojo en comparación con el fondo. E. Ejemplos de estímulo somático inducida por Ca ^{2 +} respuestas individuales de GFP-etiquetados neuronas en diferentes áreas del cerebro (hipotálamo Pe, núcleo periventricular; hipotálamo DM, dorsomedial, Arco, núcleo arqueado). Área bajo la curva (AUC) se representa por el área roja. La distinta Ca ^{2 +} señales entre las neuronas que expresan GnRHR de núcleos hipotalámicos diferente puede ser comparado con las AUC como una estimación de la variación total de Ca ^{2 +} en una célula dada durante el mismo período. F. esquemáticos dibujos y diagramas que indican la ubicación de las neuronas GFP-etiquetados analizados en AE. Panel superior: la ubicación de un cerebro s coronalexión que contiene regiones del hipotálamo del cerebro (línea roja) de medio e inferior del panel:. Esquema de un corte de cerebro (en el centro) y la ampliación de su área del recuadro rojo (panel inferior) que indica con puntos rojos la posición aproximada de las neuronas registradas GFP-etiquetados de Pe, DM y el Arco muestra en E; área de color negro en el esquema del panel inferior: 3 ^º ventrículo. Baja dos diagramas son una adaptación de Paxinos y Franklin ^12. Menor número esquina izquierda indica la distancia (mm) desde Bregma.

No hay conflictos de interés declarado.