Compact Puntos Cuánticos for Imaging sola molécula

Summary

Se describe la preparación de puntos cuánticos coloidales con un tamaño minimizado hidrodinámico para imágenes de fluorescencia de una sola molécula. En comparación con los puntos cuánticos, estas nanopartículas son similares en tamaño a las proteínas globulares y están optimizados para el brillo de una sola molécula, la estabilidad contra la fotodegradación, y la resistencia a la unión no específica a proteínas y células.

Abstract

Una sola molécula de imágenes es una herramienta importante para la comprensión de los mecanismos de la función biomolecular y para la visualización de la heterogeneidad espacial y temporal de los comportamientos moleculares que subyacen a la biología celular ^1-4. Para la imagen de una molécula individual de interés, que se conjuga típicamente a una etiqueta fluorescente (tinte, proteína, perla o punto cuántico) y se observaron con epifluorescencia o de reflexión interna total de fluorescencia (TIRF) microscopía. Aunque los tintes y las proteínas fluorescentes han sido el pilar de imágenes de fluorescencia durante décadas, su fluorescencia es inestable bajo altos flujos de fotones necesarios para observar las moléculas individuales, produciendo sólo unos pocos segundos de observación antes de la pérdida completa de la señal. Perlas de látex y perlas marcada con colorante de proporcionar una mayor estabilidad de la señal, pero a expensas de tamaño hidrodinámico drásticamente más grande, que puede alterar perjudicialmente a la difusión y el comportamiento de la molécula en estudio. ntent "> Los puntos cuánticos (QDs) ofrecen un equilibrio entre estos dos regímenes problemáticos. Estas nanopartículas están compuestas de materiales semiconductores y pueden ser diseñados con un tamaño compacto hidrodinámicamente con una excepcional resistencia a la fotodegradación ^5. Por tanto, en años recientes los puntos cuánticos han sido instrumentales en que permite observación a largo plazo del comportamiento complejo macromolecular en el nivel de moléculas individuales. Sin embargo estas partículas han todavía ha encontrado que exhiben deterioro de la difusión en ambientes de hacinamiento molecular, tales como el citoplasma celular y la hendidura sináptica neuronal, donde sus tamaños son todavía demasiado grandes ^{4,6 , 7.}

Recientemente hemos diseñado los núcleos y revestimientos de superficies de puntos cuánticos para el tamaño minimizado hidrodinámico, mientras que equilibrar las compensaciones a la estabilidad coloidal, fotoestabilidad, el brillo, y de unión no específicos que han obstaculizado la utilidad de QDs compactos en el pasado ^8,9. El objetivo de este artículo es demostrarla síntesis, la modificación, y la caracterización de estos nanocristales optimizados, compuesto de una aleación Cd Hg _{x 1-x} núcleo Se recubierta con un aislante Zn Cd _{y 1-y} shell S, recubierto adicionalmente con un ligando multidentado polímero modificado con polietilenglicol corto ( cadenas PEG) (Figura 1). En comparación con los nanocristales de CdSe convencionales, Hg _{x CD 1-x} aleaciones de Se ofrecen mayores rendimientos cuánticos de fluorescencia, fluorescencia a longitudes de onda roja e infrarroja cercana para una mejor relación señal-ruido en las células, y la excitación a no citotóxicas longitudes de onda visibles. Multidentados revestimientos de polímero se unen a la superficie de nanocristales en una conformación cerrada y plana para minimizar el tamaño hidrodinámico, y PEG neutraliza la carga de la superficie para minimizar la unión no específica a las células y biomoléculas. El resultado final es un brillante fluorescente nanocristales con emisión entre 550-800 nm y un tamaño hidrodinámico total de cerca de 12 nm. Esto es en el sAME intervalo de tamaño como muchas proteínas solubles globulares en células, y sustancialmente más pequeños que los convencionales de puntos cuánticos PEGilados (25-35 nm).

Protocol

Los procedimientos de síntesis siguientes implican estándar sin aire técnicas y el uso de un vacío / colector de gas inerte; metodología detallada se puede encontrar en las referencias 10 y 11. MSDS para todas las sustancias potencialmente tóxicas e inflamables deben ser consultados antes de su uso y compuestos inflamables todo y / o aire-lábil debe alícuotas en viales sellados septo en una caja de guantes o bolsa de guantes.

1. Síntesis de seleniuro de cadmio mercurio (Hg Cd _{x 1-x} Se) Quantum Dot Cores

1. Preparar una solución 0,4 M de selenio en trioctilfosfina (TOP). Añadir selenio (0,316 g, 4 mmol) a una 50 ml de 3 ....

Results

La figura 2 muestra la absorción y fluorescencia representante de nanocristales CdSe Hg, Cd _{x 1-x} nanocristales SE después de intercambio catiónico, y Hg Cd _{x 1-x} Se / Cd _y Zn _1-y S después de nanocristales crecimiento de la concha. Los nanocristales de CdSe núcleo tienen un rendimiento cuántico de fluorescencia cerca de 15% (incluida la longitud de onda larga profundo-trampa de emisión), pero esta eficiencia cae a menos del 1% después de mercurio de cambio, p.......

Discussion

En comparación con los convencionales CdSe puntos cuánticos, aleación ternaria Hg Cd _{x 1-x} nanocristales de Se puede ajustar en tamaño y longitud de onda de fluorescencia de forma independiente. El tamaño se selecciona por primera vez durante la síntesis de nanocristales de CdSe núcleos, y la longitud de onda de fluorescencia se elige en una etapa de intercambio de cationes secundaria de mercurio, que no altera sustancialmente el tamaño de nanocristales ^9. Es importante permitir que el Hg purificad.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios (opcional)
Selenio	Sigma-Aldrich	229865
Tri-n-octilfosfina	Strem	15-6655	97% de pureza, inestable en aire
Óxido de cadmio	Sigma-Aldrich	202894	Altamente tóxico: el uso precaución
Tetradecylphosphonic ácido	PCI Síntesis	4671-75-4
Octadeceno	Alfa Aesar	L11004	El grado técnico
Hexadecilamina	Sigma-Aldrich	H7408
Difenilfosfina	Sigma-Aldrich	252964
Mercury acetato	Sigma-Aldrich	456012	Altamente tóxico: el uso precaución
1-octanotiol	Sigma-Aldrich	471836	Olor fuerte
El ácido oleico	Sigma-Aldrich	W281506
Acetato de zinc	Alfa Aesar	35792
Cadmio acetato hidrato	Sigma-Aldrich	229490	Altamente tóxico: el uso precaución
Oleilamina	Fisher Scientific	AC12954	Inestable en el aire
Azufre	Sigma-Aldrich	344621
Óxido de trioctilfosfina	Strem	15-6661	99%
Piridina	VWR	EM-PX2012-6	Anhidro
Tioglicerol	Sigma-Aldrich	M1753	Olor fuerte
Se añadió trietilamina	Sigma-Aldrich	471283	Anhidro
Diálisis tubería	Spectrum Labs	131342	20 kDa de corte
Filtro centrífugo	Millipore	UFC801024	10 kDa de corte
Monoamino-PEG	Rapp Polymere	12 750-2	750 Da
DMTMM, 4 - (4,6-dimetoxi-1 ,3,5-triazin-2-il)-4-metilmorfolinio hidrato de cloruro	Alfa Aesar	H26333
AKTAprime Plus sistema de cromatografía	GE Healthcare
Superose 6 10/300 GL cromatografía en columna	GE Healthcare	17-5172-01
Agarosa, OmniPur	VWR	EM-2120
			Apéndice Síntesis de mercurio octanethiolate: Se añade lentamente una solución de metanol de acetato de mercurio (1 eq.) A una solución en agitación de 1-octanotiol (3 eq.) E hidróxido de potasio (3 eq.) En metanol a temperatura ambiente. Aislar el mercurio (II) octanethiolate precipitado por filtración, lavar dos veces con metanol y una vez con éter, y luego se seca a vacío. Síntesis de polímero multidentado: Disolver ácido poliacrílico (1 g, 1.773 Da) en 25 ml de dimetilformamida (DMF) en un 150 ml de tres bocas y de la burbuja con argón durante 30 min. Añadir una solución anhidra de cisteamina (374 mg, 4,87 mmol) en 10 ml de DMF. A temperatura ambiente con agitación vigorosa, se añade lentamente diisopropilcarbodiimida anhidro (DIC, 736 mg, 5,83 mmol) durante 30 min, seguido de trietilamina (170 l, 1,22 mmol), y permitir que la reacción continúe durante 72 horas a 60 ° C. Añadir mercaptoetanol (501 mg, 6,41 mmol) para inactivar la reacción, y se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. Eliminar la DMF por evaporación rotatoria y aislar el polímero con la adición de una mezcla 2:1 de acetona enfriada con hielo: cloroformo, seguido de centrifugación. Se disuelve el polímero en ~ 5 ml de DMF anhidro, se filtro, precipitado de nuevo con éter dietílico, y repetir. Se seca el producto al vacío y en atmósfera de argón tienda. Determinación del diámetro del núcleo de CdSe: A partir del espectro de absorción UV-Vis determinar la longitud de onda de la primera pico excitón (λ, en nm), que es el pico más larga longitud de onda (por ejemplo, aproximadamente 498 nm para CdSe en la Figura 2a), y utilizar el dimensionamiento curva de Mulvaney y compañeros de trabajo 12: Determinación de la concentración de nanocristales CdSe: Desde un fondo sustraído de UV-Vis espectro de una solución ópticamente transparente de nanocristales de CdSe, determinar la longitud de onda de absorción a 350 nm. Las diluciones en serie se puede utilizar para determinar si la absorción óptica está dentro del rango lineal de la ley de Beer. La concentración de nanocristales (QD, en M) puede determinarse enchufando el diámetro de nanocristales (D, en nm), el valor de absorción óptica (A 3sa), y la longitud del camino cubeta (l, en cm) en la siguiente ecuación a partir la correlación empírica de Bawendi y compañeros de trabajo 13: