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Summary

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

Abstract

Doble filamento se rompe (DSBs) son el ADN más perjudicial lesiones que una célula pueda encontrar. Si se deja sin reparar, DSBs gran puerto potencial para generar mutaciones y aberraciones cromosómicas ^1. Para evitar este trauma de catalizar la inestabilidad genómica, que es crucial para las células para detectar DSBs, activan la respuesta al daño del ADN (DDR), y reparar el ADN. Cuando se estimula, el DDR trabaja para preservar la integridad genómica mediante la activación de detención del ciclo celular para permitir la reparación a tener lugar o forzar la célula a la apoptosis. Los mecanismos predominantes de reparación de DSB ocurrir a través de nonhomologous fin de unirse (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR) (revisado en ^2). Hay muchas proteínas cuyas actividades deben estar precisamente orquestada por la RDA para funcionar correctamente. En este documento, se describe un método para 2 – y 3-dimensional (D) la visualización de una de estas proteínas, 53BP1.

La proteína p53 de unión 1 (53BP1) se localiza en áreas deDSBs por la unión a las histonas modificadas ^3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos ^5. Las modificaciones de las histonas y el reclutamiento de proteínas DDR 53BP1 y otro a sitios de DSB se cree que facilita la reorganización estructural de la cromatina alrededor de las áreas de daño y contribuir a la reparación del ADN ^6. Más allá de la participación directa en la reparación, funciones adicionales han sido descritos para 53BP1 en el DDR, tales como la regulación de un puesto de control intra-S, un punto de control G2 / M, y la activación de proteínas aguas abajo de DDR ^7-9. Recientemente, se descubrió que 53BP1 no formar focos en respuesta al daño del ADN inducido durante la mitosis, en vez de espera para entrar en las células G1 antes de localizar a la vecindad de DSBs ^6. Proteínas tales como DDR 53BP1 han encontrado asociación con estructuras mitóticas (tal como cinetocoros) durante la progresión a través de mitosis ^10.

En este protocolo se describe el uso de 2 – y 3-D imágenes de células vivas para visualizarla formación de focos 53BP1 en respuesta al agente que daña el ADN camptotecina (CPT), así como el comportamiento de 53BP1 durante la mitosis. La camptotecina es un inhibidor de topoisomerasa I que causa principalmente DSBs durante la replicación del ADN. Para lograr esto, se utilizó una anteriormente descrita 53BP1-mCherry proteína de fusión fluorescente construir consta de un dominio de proteína 53BP1 capaz de unirse DSBs ^11. Además, se utilizó una histona H2B-GFP proteína de fusión fluorescente construir capaz de monitorear dinámica de la cromatina a través del ciclo celular, pero en particular durante la mitosis ^12. Imágenes de células vivas en múltiples dimensiones es una excelente herramienta para profundizar en nuestra comprensión de la función de las proteínas de DDR en las células eucariotas.

Protocol

A. Preparación de la célula

1. Fibroblastos humanos normales primarios (GM02270) se obtuvieron de Coriell Cell Repository, Camden, Nueva Jersey, y se inmortalizan con hTERT ^6. Las células se hicieron crecer y se expandieron en CellStar 6 cm de platos en los medios de comunicación (4 ml) que consiste en MEM suplementado con 20% fetal suero bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sodio, y penicilina / estreptomicina (HyClone ).
2. De riñón embrionario humano 293 (HEK293) las células se obtuvieron a partir de American Type Culture Collection y se desarrollaron y se expandieron en CellStar 6-cm platos. Las células se mantuvieron en medios de comunicación (4 ml) que consiste en DMEM suplementado con fetales 10% de suero bovino, no aminoácidos esenciales, L-glutamina, y penicilina / estreptomicina.
3. 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; Addgene plásmido 19836) y H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plásmido 17735) gen constructos de fusión también expresar puromicina o genes de resistencia a G418, respectivamente, fueron transducidas (fibroblapts) o transfectadas (HEK293) utilizando SuperFect (Qiagene) en las células y se mantiene en la selección de medicamentos. Mantenimiento de la fluorescencia se comprobó periódicamente.
4. 24-48 h antes de la adquisición de imágenes, las células se trataron con tripsina en una única suspensión de células y se sembraron a una densidad baja en placas de 3,5 cm de FluroDish fondo de cristal.

B. Configuración del microscopio y de adquisición de imágenes

Este protocolo fue desarrollado utilizando la Célula Zeiss Observador SD hilado disco microscopio confocal equipado con un AxioObserver Z1 stand, un dual-channel Yokagawa CSU-5000 X1A girar la unidad de disco, 2 Fotometría QuantEM 512SC cámaras EMCCD, un HXP 120C a base de fibra de iluminación, 4 láseres (un Lasos 100mW de varias líneas de argón [458, 488, 514 nm], 50 mW diodo 405 nm, 40 mW diodo 561 nm y 30 mW diodo 635 nm), AOTF, un Pecon XL etapa multiS1 sistema de incubación, incubación Zeiss módulos (Módulo de O ₂ S, CO ₂ Módulo S, S TempModule, Calefacción Unidad XL S) y un Prior motorized XY etapa con un inserto NanoScanZ piezo Z. Para reducir al mínimo las aberraciones esféricas, mientras que las células de formación de imágenes en vivo apoyado en un medio acuoso, un Agua C-Apochromat 63x/1.20 / Corr objetivo y lente Zeiss Immersol fluido de inmersión W (con un índice de refracción n = 1,334) fueron utilizados. Para canal 2 confocal de imágenes, un RQFT 405/488/568/647 espejo dicroico y BP525/50 (verde) y BP629/62 (rojo) se utilizaron filtros de emisión. El software del sistema utilizado fue Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) con AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fisiología, Mosaix, Mark & ​​Find, de doble cámara, Interior 4D, enfoque automático y 3-D módulos de deconvolución.

1. Asegúrese de que el CO ₂ gas se está ejecutando para el CO ₂ Módulo del sistema de incubación. Si el microscopio se apoya en una mesa de aire anti-vibración, abra el suministro de aire (o _gas N2) para la tabla del aire.
2. Encienda la alimentación del trípode del microscopio, la unidad de disco giratorio, las cámaras, los módulos de incubación, iluminación HXP, platina motorizada, Argonláser, y el ordenador.
3. Después de 1 minuto de tiempo de calentamiento, gire la llave de contacto para que el láser de argón a "On".
4. En el panel de control del láser Zeiss, encienda los interruptores de las líneas de láser que se utilizarán.
5. Apague el interruptor de palanca para el controlador Lasos láser de argón de "espera" a "run láser" y ajustar el regulador de luz para el nivel óptimo (es decir, justo por debajo del punto en que el indicador verde se vuelve roja).
6. Inicie el software AxioVision Nota:. La interfaz de usuario para AxioVision pueden ser personalizados con menús de las ventanas y tirar hacia abajo que sean específicos para el microscopio especial y los componentes que lo controla. Como tal, cada sistema tiene una interfaz potencialmente única. Por lo tanto, las instrucciones generales para la manipulación de software se proporcionan en los siguientes pasos, en lugar de direcciones para las ventanas de software específicos, fichas y / o menús desplegables.
7. Aproximadamente 1 h antes de la formación de imágenes, en el software, localizar los controles de la incubadora yencender la calefacción de la cámara superior y la placa de la platina. Ajustar la temperatura a 37 ° C. Encienda el CO ₂ Control y ajuste el nivel del 5%.
8. Seleccione la lente objetivo para formación de imágenes. En este estudio, un 63x/1.20 NA C-Apochromat Agua / Corr lente objetivo se utilizó Nota:. Para este objetivo, un medio de inmersión con un índice de refracción similar al del agua (Zeiss Immersol fluido de inmersión W) es necesario.
9. Si múltiples posiciones separadas son objeto de muestreo durante un largo período de tiempo, de aplicar una cantidad suficiente de medio de inmersión para asegurar que es transportada desde una posición a otra.
10. Colocar el plato de la etapa y llevar la lente del objetivo arriba en contacto con el fondo.
11. Usando los controles del microscopio o del software, dirigir la luz emitida a los oculares y seleccione el filtro de campo amplio establecido para la señal fluorescente de interés (para este estudio, "Red" filtro para 53BP1 y un "buenas prácticas agrarias" filtro para H2B ). </ Li>
12. Ver a través de las lentes oculares, enfocar la imagen, y localizar un campo adecuado de células.
13. Utilizando el software o los controles del microscopio, dirigir la luz emitida fuera de los oculares al puerto con la unidad de disco giratorio confocal.
14. En el software, encienda el láser adecuado (para este estudio, el láser nm 561 por 53BP1 y la línea de 488 nm del láser de argón para H2B).
15. Para cada canal, ajustar la intensidad del láser mediante el ajuste del filtro acústico-óptico sintonizable (AOTF) de control a un nivel apropiado.
16. Seleccione el espejo dicroico apropiado (RQFT 405/488/568/647) y filtros de emisión (BP 629/62 para 53BP1 y BP 525/50 para H2B). Abrir el obturador a la unidad de disco giratorio.
17. Seleccione la opción "Live" ventana para mostrar el actual campo de visión.
18. En el software, abra el "cámara" de control, seleccione la cámara que desea utilizar (si es un sistema de cámara dual) y establecer el tiempo de exposición a aproximadamente 100 ms. Ajuste el% y ganar EM como necsario Nota:. La construcción 53BP1-mCherry parece un tanto débil. Nos pareció que es útil para aumentar la ganancia EM.
19. En el software, abra el control de la unidad de disco giratorio confocal y ajustar la velocidad de giro del disco introduciendo el tiempo de exposición de la cámara que se configuró para capturar una imagen adecuada (por ejemplo, ~ 100 ms). Haga clic en "Set" para guardar los cambios.
20. Abra "multi-dimensional de adquisición". Seleccione la pestaña de canales y cargar / seleccionar los canales apropiados. Para este estudio, estamos utilizando canales definidos para dsRed (561 nm láser de excitación y BP 629/62 filtro de emisión) y las buenas prácticas agrarias (488 nm láser de línea para la excitación y BP525/50 filtro de emisión).
21. Para asegurar el registro de imagen, un espejo dicroico común (RQFT 405/488/568/647) se utilizó para ambos canales. Configure el software de "Autofoco" Nota:. Vaya a Herramientas → Configuración de editor para ajustar los valores de MDA. Asegúrese de que la potencia del láser adecuado se establece ("láser de potencia adecuada" se refiere a una opción que le permitepara excitar el fluoróforo apropiado mientras se minimiza foto-blanqueamiento).
22. En la ventana MDA, seleccione la pestaña z-stack. Seleccione "Z-stack en la posición de foco actual". Ajuste el rango de ~ 10 m z-pila y elija "óptimo" para el número de pasos para asegurar un muestreo de Nyquist a través de Z. Nota: El tamaño exacto de la z-stack dependerá de la altura de sus células. Ajuste en consecuencia.
23. 23. Haga clic en "Inicio" y analizar el resultado z-stack en la imagen para asegurar la configuración es apropiada para lo que se está investigando (por ejemplo, en este estudio, es importante para la imagen del núcleo entero).
24. Seleccione la opción "T" (tiempo) ficha. Para nuestro experimento con camptotecina, se establece el intervalo entre los puntos de tiempo de formación de imágenes a 5 min y la duración total de la sesión de 1 hora para un control (células no tratadas) video Nota:. Para minimizar foto-blanqueamiento de las células, el experimento debe ser configurado de tal manera que el AOTF espacios en blanco el láser entre los puntos de tiempo de formación de imágenes.
25. Fo múltiples puntos de imagen de varias células en el plato, en la ventana MDA, seleccione la ficha posición. Asegúrese de "Aplicar" ajuste antes / después de punto en el tiempo "posición por" está marcada. Seleccione "Mark_Find". Usando el "Live" vista, mueva el plato alrededor y seleccionar los campos apropiados de vista.
26. Haga clic en "Inicio" en el menú multi-dimensional de adquisición para iniciar el experimento y grabar un vídeo de control (de las células no tratadas).
27. Después de que el control de vídeo, añadir el tratamiento apropiado (en este caso, 10 camptotecina mM). Se registró el experimental (droga células tratadas) de vídeo a intervalos de 5-10 min 2-4 h Nota:. Una cuestión importante a tener en cuenta es la velocidad con que se produce un efecto determinado después del tratamiento. Como se ve en el video, 53BP1 focos comienzan a partir de ~ 5 min después de la adición de CPT. Aunque es un proceso relativamente fácil, y agregó droga para el plato manualmente y volver a calibrar el microscopio toma tiempo. Hay que prestar atención a esto cuando el diseño de experimentos.
28. Para el seguimiento de mitosis, fijamos el intervalo de 7,5 minutos y grabado durante 4-5 horas (la configuración específica dependerá de la línea celular utilizada y la duración de su ciclo celular). Los ajustes que tenga que hacer para evitar que la foto-blanqueamiento durante grabaciones más largas.

C. Procesamiento de imágenes y análisis

Este protocolo fue desarrollado usando software Volocity (PerkinElmer). El software utilizado para adquirir la información (AxioVision) también tiene la capacidad para procesar y analizar imágenes. Los usuarios están invitados a utilizar el software a su disposición, y consulte la bibliografía adecuada en cuanto a su aplicación.

1. Abra el software Volocity. Crear y nombrar una nueva biblioteca, e importar los archivos de vídeo.
2. Para ver los archivos, por lo general les resulta más útil usar el "Focus extendido" de ajuste. Esta superpone las rebanadas z-stack y, para este protocolo, nos permite visualizar los focos 53BP1 en las diferentes áreas del núcleo.
3. Ajuste vídeos como sea necesario. Volocity está equipado con una gama de herramientas para mejorar la calidad de las imágenes adquiridas. Al asegurarse de que los ajustes del microscopio eran apropiadas, mucho tiempo se pueden guardar en la edición más adelante. A menudo, es útil para deconvolucionar sus imágenes y ajustar el brillo / contraste. Sus necesidades de edición específicas pueden variar basado en el experimento.
4. Añadir una marca de tiempo relativo y la barra de escala.
5. Para ver las células en 3-D, cambie a la "3-D opacidad" de ajuste. Esto permite la rotación de las células en 3-D prestados en el espacio, proporcionando así múltiples perspectivas de estructuras de interés dentro de las células Nota:. Es útil para visualizar las células en diferentes planos para determinar donde las estructuras de los viajes interés. Por ejemplo, en el "Focus extendida" ajuste es difícil discernir que el 53BP1 es, de hecho, se disocian de ADN durante la mitosis. Sin embargo, esto es fácilmente evidente en 3-D.
6. Las películas y las imágenes fijas pueden ser exportados a una variedad de tipos de archivos basado en la preferencia del usuario. </l i>

D. Representante Resultados

Un ejemplo de 53BP1 formación de focos en respuesta a la CPT se muestra en la figura 1. Las células expuestas a forma CPT focos dentro de 5-10 minutos, y mantener estos focos durante toda la duración de la grabación. Como se muestra en la Figura 2, 53BP1 disocia de la cromatina en el inicio de la mitosis, formando una fina neblina alrededor de los cromosomas de condensación. Como telofase se produce la mitosis y llega a su fin, 53BP1 una vez más agregados en distintos focos. Mientras que las células HEK293 no fueron expuestos a CPT, que sin embargo forman focos abundante, reparación espontánea 53BP1 generado por el daño del ADN endógeno. Esta observación nos permitió concluir que 53BP1 no formar focos durante la mitosis temprana, de acuerdo con un informe anterior que muestra un efecto similar después de la exposición de las células a la radiación ionizante y las drogas radiomiméticos ^5.

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Figura 1. Camptotecina (10 mM) y provoca DSBs 53BP1 formación de focos en el ciclismo fibroblastos dentro de 30 min de la adición del fármaco al medio.

Figura 2. 53BP1 no formar focos durante la mitosis hasta telophase/G1 en células HEK293.

Discussion

Mantenimiento de la integridad genómica es crucial para la supervivencia celular. El incumplimiento de preservar los resultados del genoma en el envejecimiento prematuro, la carcinogénesis, o la muerte ^8. Hay un gran interés en discernir cómo funciona el DDR, derivadas de su importancia para la investigación básica y clínica. Muchas técnicas se han desarrollado a lo largo de los años para ayudar en el estudio de cómo las células detectar y reparar el daño del ADN. Los métodos tradicionales como la inmunocitoquímica y Western Blot han sido pilares fundamentales de la materia, aunque los recientes avances en la tecnología han permitido a métodos cada vez más sofisticados para evolucionar. Vivo de imágenes de células, como se detalla en este protocolo, nos permite estudiar las características de la DDR pasados ​​por alto por las técnicas más tradicionales.

Central para el uso de imágenes de células vivas es la creación de proteínas marcadas fluorescentemente. Aquí se describe el uso de una proteína marcada con mCherry involucrados en el DDR, 53BP1, así como una histona H2B-GFP producto de fusión. Proteínas marcadas fluorescentemente se utilizan ampliamente en la biología molecular y celular, sin embargo, no son sin sus limitaciones. Colocación de una nueva estructura de una proteína endógena crea el riesgo evidente de alteración de la función natural. Adicionalmente, ciertas construcciones pueden y serán expresadas en diferentes niveles en diferentes líneas celulares, en diversas condiciones. Hemos observado niveles divergentes de intensidad de fluorescencia en todas las células de ingeniería genética utilizadas en este estudio. El 53BP1 construir utilizada en este protocolo carece de dominios más funcionales, sin embargo, retiene la capacidad de unirse a los sitios de daño de ADN que no parece afectar negativamente a la celda ^2.

Además, es importante tener en cuenta el método de entrega de genes. En este protocolo, se utilizaron dos métodos: la transducción lentiviral y transfección estable. Nuestros lentivirus de las células infectadas de forma estable transducidas con el constructo fluorescente;por lo tanto, continuarán para expresar estas proteínas indefinidamente. Sin embargo, este método es algo más mano de obra en comparación con la transfección y es dictada por qué tipo de células son el blanco; algunas células no son susceptibles de transfección eficiente. Por otro lado, los lentivirus son capaces de entrar en la mayoría de las células, incluyendo humanos. Los investigadores se les anima a sopesar los pros y los contras de cada método cuando se trata de sus propios experimentos. Como un posible medio de eludir los problemas inherentes a las proteínas marcadas con fluorescencia, el uso de células permeables a sondas marcadas fluorescentemente se informó recientemente de experimentos de células vivas ^10. Sin embargo, esta técnica todavía no se ha desarrollado completamente.

Una ventaja principal de imágenes de células vivas es la posibilidad de estudiar las relaciones espacio-temporales de la RDA y la reparación de DSB. En efecto, Dimitrova et al. (2008) fueron capaces de observar la etiqueta fluorescente células vivas y en revelar novelaformación con respecto a la unión a los telómeros 53BP1 y cómo afecta a la dinámica de la cromatina. Este análisis sería mucho más difícil, aunque no imposible, con otros métodos. Tener la capacidad de monitorear el DDR en el espacio y el tiempo nos permite discernir las funciones y relaciones que de otro modo podrían pasar por alto.

En resumen, utilizando imágenes de células vivas permite a los investigadores para controlar la cinética de formación de DSB y resolución en tiempo real, y permite el análisis cuantitativo en una única célula. Además de la técnica utilizada en este estudio, otras aplicaciones de imágenes de células vivas pueden ser utilizados, tales como FRET y FRAP ^3. La tecnología de la observación de las células en tiempo real continuará a ser mejorado y utilizado para estudiar una variedad de procesos celulares.

Materials

CellStar culture dishes	Greiner Bio-one
FluroDish glass bottom dishes	World Precision Instruments, Inc.
MEM media	GIBCO
Non-essential amino acids	GIBCO
Amino acids	GIBCO
Vitamins	GIBCO
Sodium Pyruvate	Invitrogen
Penicillin/Streptomycin	HyClone
Fetal Bovine Serum	GIBCO
N-Myc-53BP1 WT pLPC-Puro;<br/> plasmid 19836	Addgene
pCLNR-H2BG; plasmid 17735	Addgene
SuperFect	Qiagen
Zeiss Cell Observer SD Imaging system	Zeiss
AxioVision (release 4.8.2)	Zeiss
Zeiss Immersol W Oil	Zeiss
Volocity software (version 6.0)	PerkinElmer