Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Resumen

Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.

Resumen

Los protocolos existentes para la generación de neuronas a partir de células madre pluripotentes (hPSCs) suele ser tedioso, ya que son procedimientos de múltiples etapas que implica el aislamiento y la expansión de las células precursoras neurales, antes de la diferenciación terminal. En comparación con estos métodos consumen mucho tiempo, recientemente se ha encontrado que la inhibición combinada de tres vías de señalización, TGFβ/SMAD2, BMP/SMAD1, FGF y / ERK, promueve la rápida inducción de la neuroectodermo de hPSCs, seguido de inmediato diferenciación en neuronas funcionales. Aquí, hemos adaptado nuestro procedimiento para un formato de placa novela multititre, para mejorar aún más su reproducibilidad y para que sea compatible con mediados de rendimiento de las aplicaciones. Se compone de cuatro días de formación neuroectodermo en esferas flotantes (cuerpos embrioides), seguido por un período de cuatro días de diferenciación en neuronas en condiciones adherentes. La mayoría de las células obtenidas con este protocolo parecen ser las neuronas sensoriales bipolares. Por otra parte,el procedimiento es altamente eficaz, no requiere habilidades particulares de expertos, y se basa en un simple medio químicamente definido con rentables moléculas pequeñas. Debido a estas características, el procedimiento puede servir como una plataforma útil para la investigación funcional adicional, así como para el cribado basado en células humanas se aproxima requiere neuronas sensoriales o neuronas de cualquier tipo.

Introducción

hPSCs, que comprende embrión derivado de células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs), son pluripotentes sentido de que pueden dar lugar a diversos linajes celulares in vitro ^1-2. Numerosos tipos de células diferenciadas se han derivado de hESCs hasta la fecha, apoyando la idea de que estas células presentan valiosas herramientas para la investigación científica y basados ​​en células enfoques de cribado, y mantienen la promesa para células basadas en la terapéutica.

Protocolos de diferenciación neuronal para hESCs son generalmente complejas y requiere mucho tiempo, ya que....

Protocolo

1. Preparación de Matrigel recubiertos con placas y los medios

1. Preparación de Matrigel recubierto con Matrigel placas se ha encontrado que es un sustrato preferido para la unión de diferenciar EBs y también promueve la excrecencia eficiente de las neuronas de estos ^10.
   1. Descongelar 10 ml de noche en hielo Matrigel.
   2. Al día siguiente, se diluye la Matrigel gelatinosa con dos volúmenes de hielo frío DMEM/F-12 y preparar partes alícuotas de 1 ml en tubos de 15 ml preenfriados cónicos que pueden almacenarse congeladas a -20 ° C.
   3. Decidir sobre un formato de placa para la diferenciación neuronal. Por ejemplo, como punto de p....

Resultados

En nuestro informe anterior, en línea con muchos otros, EBS desde hPSCs podría generarse simplemente replating agregados sobre la división de rutina de hPSCs en platos de baja fijación ^10. Esto usualmente resulta en una amplia distribución de tamaños de EB resultantes (Figura 1 C, arriba). Otro problema que resulta de esto es que EBS mantienen en suspensión tienden a agregarse entre sí, dando lugar a una heterogeneidad aún mayor de tamaños de EB. Para evitar estos problemas, por lo tanto, int.......

Discusión

La mayoría de los protocolos de diferenciación que implican la formación de EB hPSCs, incluyendo nuestro procedimiento previamente publicado ^10, se basa en el manual o con ayuda de enzima de recolección hESCs como agregados, lo que inevitablemente conduce a la heterogeneidad en los tamaños de EB. Este hecho conduce a variabilidad en la eficacia con la diferenciación de algunas líneas celulares, haciendo así difícil análisis sistemáticos, en particular, a una escala de rendimiento medio. Además, la disección m.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Matrigel HC	Becton Dickinson	354263	Ver texto para más detalles sobre el manejo de
DMEM/F-12	Life Technologies	21331-020
Poli (alcohol vinílico)	Sigma	363170	Disolver en 0,4% en DMEM/F-12 utilizando un baño de agua ultrasónico / evitar el sobrecalentamiento / puede mantenerse a 4 ° C durante varias semanas
Suplemento N2	Life Technologies	17502-048	100X, almacenar como alícuotas congeladas
B27 Suplemento	Life Technologies	12587-010	Tienda 50X, como alícuotas congeladas
Albúmina de suero bovino	Sigma	A1595	10% = 500X, almacenar en alícuotas congeladas
L-Glutamina con penicilina / estreptomicina	PAA	P11-013	O el equivalente
FGF2	Peprotech	100-18B	Disolver en 10 ug / ml en 0,1% de BSA / PBS = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
ROCA inhibidor Y-27632	abcamBiochemicals	Asc-129	Disolver en 10 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
PBS	PAA	H15-002	O el equivalente
Accutase	PAA	L11-007
96-y de fondo en V placas	Nunc	277143
PD0325901	Axon MedChem	Axon 1408	Disolver en 0,5 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
SB431542	abcamBiochemicals	Asc-163	se disuelven a 15 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
Dorsomorphin	Santa Cruz	sc-200689	disolver en 0,5 mM en DMSO = 1000X tienda, como alícuotas congeladas
U de 96 pocillos de fondo ultra bajo placas de fijación	Corning	7007
beta-tubulina III anticuerpos (ratón)	Sigma	T8660	utilizar a 1:1000
beta-tubulina III anticuerpos (conejo)	Covance	PRB-435P	utilizar a 1:2000
Brn3a (POU4F1) de anticuerpos	Santa Cruz	sc-8429	utilizar a 1:500
			Tabla 1. </ Strong> reactivos y equipos específicos.