Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

Resumen

Aquí presentamos un método para el cambio fotoactivado de proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFPs) en embriones vivos de pez cebra y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida en puntos temporales específicos durante el desarrollo. Esta metodología permite el monitoreo de eventos de biología celular subyacentes a diferentes procesos de desarrollo en un organismo vertebrado vivo.

Resumen

La embriogénesis es un proceso dinámico que se estudia mejor mediante técnicas que permiten documentar los cambios del desarrollo in vivo. El uso de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente ha demostrado ser una estrategia valiosa para elucidar los procesos morfogenéticos dinámicos tal como ocurren en el organismo intacto. Durante la última década, el desarrollo de proteínas fluorescentes fotoactivables y fotoconvertibles ha abierto la posibilidad de investigar el destino de subpoblaciones discretas de proteínas marcadas¹. A diferencia de las proteínas fotoactivables, las proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFP) pueden rastrearse e imagenarse fácilmente en su estado de emisión nativo antes de la fotoconversión, lo que facilita la identificación y selección de regiones mediante inspección óptica. Las PCFP, como Kaede², KikGR³, Dendra⁴ y EosFP⁵, pueden cambiar de verde a rojo tras la exposición a luz UV o azul debido a una secuencia tripeptídica His-Tyr-Gly que forma un cromóforo verde que puede fotoconvertirse en uno rojo mediante una β-eliminación catalizada por luz y posterior extensión de un sistema π-conjugado³. Las PCFP y sus variantes monoméricas son herramientas útiles para el seguimiento de células^6-10 y el estudio de la dinámica de proteínas^11-14, respectivamente. En los últimos años, las PCFP se han expresado en diferentes modelos animales, como el pez cebra⁶, el pollo^7,8 y el ratón^9,10, para el seguimiento del destino celular. Aquí presentamos un protocolo para la fotoconversión específica de células mediante PCFP en embriones vivos de pez cebra y el posterior seguimiento de las proteínas fotoconvertidas en etapas posteriores del desarrollo. Esta metodología permite estudiar, de manera específica para cada tejido, los eventos biológicos celulares que subyacen a la morfogénesis en el modelo animal del pez cebra.

Protocolo

1. Obtención de embriones para el ensayo de fotoconversión

Tras el cruce entre individuos transgénicos de pez cebra que expresan un PCFP, se seleccionan los embriones homocigotos más brillantes y se cultivan a 28,5 °C hasta alcanzar la etapa embrionaria deseada¹⁵.

Nota 1: Esta preselección permitirá escanear embriones con baja potencia láser, evitando así la fototoxicidad y el fotoblanqueo.

Nota 2: Sugerimos utilizar luz de baja intensidad al visualizar embriones y mantenerlos en condiciones de oscuridad debido a la alta sensibilidad de las PCFP, como Kaede y KikGR, a la expos....

Discusión

En los últimos años, se han generado modelos animales transgénicos para la expresión de proteínas fotocambiables como Kaede o KikGR. Estos animales se desarrollan normalmente, lo que indica que estas proteínas no tienen efectos tóxicos sobre el desarrollo embrionario. El primer informe sobre un ensayo de fotocambio para el seguimiento de células en embriones animales fue realizado por Hatta y colaboradores mediante la inyección de ARNm o ADN que codifica Kaede en embriones de pez cebra de una sola célula para una expresi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales:
Equipo necesario para criar peces y recolectar huevos (véase el Zebrafish Book22 para más detalles).
Micróscopio estereoscópico	Leica	Lecia MZ6 Stereomicroscope	Equipado con láser que opera a 488 nm
Micróscopio confocal de barrido láser	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	equipado con láseres que operan a 488 nm, 561 nm y 405 nm
Bloque calefactor
Par de pinzas Dumont n.º 5
Placa de cultivo con fondo de cubreobjetos de vidrio	MatTek Corp		Ashland MA USA
Puntas de micropipeta Microloader	Eppendorf
Vórtex
Agujas
Reactivos:
Medio de agua para huevos
60 μg/ml de sales marinas Instant Ocean en ddH2O
Medio E3
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (p/v) Azul de metileno
Solución stock de Tricaina 4 mg/ml
400 mg de Tricaina (etiléster del ácido 3-amino benzoico)	Sigma-Aldrich
97,9 ml de ddH2O
2,1 ml de Tris 1 M (pH 9)
Ajustar a pH 7, alícuotas y almacenar a -20 °C
Agarosa de baja temperatura de fusión (LMA, Lonza) al 1%
1 g de LMA/100 ml de medio E3 1X
Alícuotas y almacenar a 4 °C