Aquí presentamos un método para el cambio fotoactivado de proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFPs) en embriones vivos de pez cebra y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida en puntos temporales específicos durante el desarrollo. Esta metodología permite el monitoreo de eventos de biología celular subyacentes a diferentes procesos de desarrollo en un organismo vertebrado vivo.
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Artículo de método
Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra
En este artículo
Resumen
Resumen
La embriogénesis es un proceso dinámico que se estudia mejor mediante técnicas que permiten documentar los cambios del desarrollo in vivo. El uso de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente ha demostrado ser una estrategia valiosa para elucidar los procesos morfogenéticos dinámicos tal como ocurren en el organismo intacto. Durante la última década, el desarrollo de proteínas fluorescentes fotoactivables y fotoconvertibles ha abierto la posibilidad de investigar el destino de subpoblaciones discretas de proteínas marcadas1. A diferencia de las proteínas fotoactivables, las proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFP) pueden rastrearse e imagenarse fácilmente en su estado de emisión nativo antes de la fotoconversión, lo que facilita la identificación y selección de regiones mediante inspección óptica. Las PCFP, como Kaede2, KikGR3, Dendra4 y EosFP5, pueden cambiar de verde a rojo tras la exposición a luz UV o azul debido a una secuencia tripeptídica His-Tyr-Gly que forma un cromóforo verde que puede fotoconvertirse en uno rojo mediante una β-eliminación catalizada por luz y posterior extensión de un sistema π-conjugado3. Las PCFP y sus variantes monoméricas son herramientas útiles para el seguimiento de células6-10 y el estudio de la dinámica de proteínas11-14, respectivamente. En los últimos años, las PCFP se han expresado en diferentes modelos animales, como el pez cebra6, el pollo7,8 y el ratón9,10, para el seguimiento del destino celular. Aquí presentamos un protocolo para la fotoconversión específica de células mediante PCFP en embriones vivos de pez cebra y el posterior seguimiento de las proteínas fotoconvertidas en etapas posteriores del desarrollo. Esta metodología permite estudiar, de manera específica para cada tejido, los eventos biológicos celulares que subyacen a la morfogénesis en el modelo animal del pez cebra.
Protocolo
1. Obtención de embriones para el ensayo de fotoconversión
Tras el cruce entre individuos transgénicos de pez cebra que expresan un PCFP, se seleccionan los embriones homocigotos más brillantes y se cultivan a 28,5 °C hasta alcanzar la etapa embrionaria deseada15.
Nota 1: Esta preselección permitirá escanear embriones con baja potencia láser, evitando así la fototoxicidad y el fotoblanqueo.
Nota 2: Sugerimos utilizar luz de baja intensidad al visualizar embriones y mantenerlos en condiciones de oscuridad debido a la alta sensibilidad de las PCFP, como Kaede y KikGR, a la exposición a la luz, incluyendo la luz solar.
2. Inclusión
- En un recipiente de vidrio con agua para huevos, descorionar embriones bajo un estereomicroscopio utilizando pinzas.
- Anestesiar embriones transfiriendo un embrión descorionado a una solución de Tricaine 0,16 mg/ml (etiléster del ácido 3-amino benzoico, Sigma-Aldrich) (40μl de una solución stock de 4 mg/ml en 1 ml de medio E3 1X).
Nota 1: Transfiera los embriones con una pipeta de vidrio o una punta cortada (P1000) para minimizar el riesgo de dañar los embriones.
Nota 2: Los embriones jóvenes descorionados no deben exponerse al aire ni levantarse hasta la interfase agua/aire, ya que los huevos se rompen fácilmente cuando se someten a estrés mecánico.
- Transfiera el embrión anestesiado sobre la tapa de una placa de cultivo y mantenga el embrión dentro del menor volumen posible de medio.
- Transfiera el embrión al agarosa pipeteando el embrión junto con agarosa al 1 % de baja temperatura de fusión (LMA, Lonza) a 30 °C que contenga Tricaine 0,16 mg/ml, y colóquelo sobre el cubreobjetos de una placa de cultivo con fondo de cubreobjetos (MatTek Corp. Ashland MA USA). Posteriormente, oriente el embrión con la ayuda de una punta plástica lisa (por ejemplo, una punta de micropipeta cortada, Microloader Pipette Tip, Eppendorf) y, cuando el LMA haya polimerizado, cubra el agarosa con solución de Tricaine 0,16 mg/ml.
Nota 1: Derrita el 1% de LMA a 60 °C y mantenga el agarosa fundido a 30 °C.
3. Fotoconversión
- En un microscopio confocal invertido equipado con fuentes láser de 405 nm, 488 nm y 561 nm, como el Zeiss LSM 710, visualice la muestra mediante un escaneo en z-Stack que cubra toda la estructura del espécimen que se va a fotoconvertir y rastrear posteriormente, utilizando el láser de 488 nm (es decir, láser Ar de 30 mW, a una intensidad del 5-7 %, detector ajustado a 493-540 nm) y el láser de 561 nm (es decir, láser DPSS 561 de 10 mW, a una intensidad del 7-9 %, detector ajustado a 587-651 nm) para escanear el tejido/órgano en busca de la fluorescencia verde y roja de las proteínas fotoconvertibles, respectivamente.
Nota 1: Para la exploración antes de la fotoconversión, utilizamos un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Nota 2: Siempre examine la fluorescencia roja antes del experimento para descartar la presencia de cualquier PCFP rojo convertido accidentalmente.
- Seleccione la herramienta Time series y configúrela para 2 ciclos sin intervalo (uno para pre y otro para post fotoconversión).
- Seleccione la herramienta Regions y defina una o más regiones de interés (ROI) para la fotoconversión.
Nota 1: Recomendamos determinar primero la precisión con la que la región convertida fotoquímicamente por el láser de barrido en el área de interés (ROI) coincide con el ROI seleccionado en el software, midiendo el área de tejido/células fotoconvertidos en las tres direcciones (xy y z) en una muestra fija en la que no se espere movimiento celular ni proteico. Para los ajustes descritos en esta aplicación, el ROI coincidió con la región fotoconvertida con gran precisión, aunque esto depende del objetivo utilizado y de la cantidad de láser aplicada para la fotoconversión. El tamaño del ROI puede reducirse hasta el tamaño de una sola célula, dependiendo de la apertura numérica del objetivo, el factor de zoom y la cantidad de luz láser utilizada para la fotoconversión.
- Seleccione la herramienta Bleaching y configúrela para comenzar el blanqueo después del escaneo 1 de 2. Utilizamos un láser de diodo de 405 nm y 30 mW para la fotoconversión y optimizamos cuidadosamente la cantidad mínima de luz láser necesaria para lograr una fotoconversión completa, lo cual se consigue principalmente ajustando la intensidad de la luz láser, el número de iteraciones de escaneo de la región de interés (ROI) y el tiempo por píxel (es decir, la velocidad de escaneo).
Nota 1: Para la fotoconversión, utilizamos un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
Nota 2: La potencia del láser y el número de iteraciones deben determinarse empíricamente para cada configuración experimental y deben asegurar la fotoconversión completa del PCFP verde a rojo dentro de la región de interés (ROI) con la cantidad mínima necesaria de luz láser para reducir la fototoxicidad. Recomendamos comenzar las pruebas utilizando una potencia baja del láser (por ejemplo, 3 %, correspondiente a 0,03 mW en el plano del objetivo) combinada con un número bajo de iteraciones (por ejemplo, 20), y posteriormente aumentar la potencia del láser hasta lograr la fotoconversión completa, lo cual en nuestro caso ocurrió con una potencia del 10 % (correspondiente a 0,1 mW en el plano del objetivo). Bajo estas condiciones, todos los embriones probados sobrevivieron al plan de tratamiento. Sin embargo, observamos que la membrana del vitelo es sensible a los pulsos del láser y puede dañarse fácilmente, provocando la muerte del embrión. Por esta razón, la letalidad embrionaria después de la fotoconversión puede ocurrir si la posición del tejido diana está cerca del cuerpo del vitelo.
- Analice la muestra mediante un z-Stack usando láseres de 488 nm y 561 nm para visualizar cualquier fluorescencia verde residual y la fluorescencia roja fotoconvertida del PCFP.
Nota 1: Para el escaneo tras la fotoconversión, utilizamos un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8.
4. Retirar el embrión del agarosa
- Deseche la solución y retire cuidadosamente el embrión del LMA al 1% con la ayuda de una aguja o una punta de plástico lisa.
- Mantenga el embrión en agua de huevo en la oscuridad a 28,5 °C hasta alcanzar la etapa de desarrollo deseada.
Nota 1: Es importante que los embriones continúen su desarrollo en agua de huevo, particularmente durante los primeros días de desarrollo, durante la extensión del cuerpo embrionario. De hecho, algunos tejidos u órganos embrionarios cambian de posición durante el desarrollo y, por lo tanto, requieren orientaciones específicas durante la inclusión, las cuales dependen del tejido u órgano de interés y del estadio de desarrollo deseado para el análisis.
5. Reincrustación
- Proceda como en el punto 2.) de este protocolo.
6. Seguimiento del tejido fotoconvertido en etapas embrionarias posteriores
- Escaneo de la región de interés (z-Stack) utilizando láseres de 488 nm y 561 nm para las señales fluorescentes verde y roja, respectivamente.
Nota 1: Para el escaneo a x horas posteriores a la fotoconversión, utilizamos un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0,8.
Nota 2: Dado que este protocolo no afecta el desarrollo normal del embrión, es posible observar el embrión fotoconvertido en etapas posteriores del desarrollo (para ello, proceda según lo descrito en los puntos 4 - 6).
7. Resultados representativos
Un ejemplo de un ensayo de fotoconversión se muestra en la Figura 1. Rastreamos células endoteliales durante el desarrollo del pez cebra (para una revisión de la anatomía vascular del pez cebra en desarrollo, véase16). Por ello, utilizamos una línea reportera de pez cebra Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 que expresa KikGR dentro de los núcleos endoteliales17. Los embriones homocigotos y de expresión intensa se criaron a 28,5 °C hasta las 48 horas post-fecundación (hpf). Tras la descorionación, los embriones se anestesiaron e incrustaron en LMA, colocando el lado anterior-dorsal del embrión hacia el cubreobjetos para una mejor visualización de los vasos de la cabeza. Utilizamos un microscopio confocal invertido (Zeiss LSM 710 Meta) equipado con láseres de 405 nm, 488 nm y 561 nm, y un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0,8 para el ensayo de fotoconversión y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida. Como se muestra en la Figura 1A, antes de la fotoconversión, KikGR se expresaba dentro del tejido endotelial y solo era detectable como fluorescencia verde mediante un láser de Argón de 488 nm. Escaneos de control con un láser DPSS 561-10 de 561 nm para fluorescencia roja no detectaron ninguna señal de KikGR fotoconvertido antes del proceso de fotoconversión (Figura 1A). Posteriormente, la región de interés (ROI) se fotoconvirtió completamente utilizando un láser de diodo de 405 nm (al 10 % de intensidad, 20 iteraciones) y los vasos de la cabeza se escanearon nuevamente con los láseres de 488 nm y 561 nm (Figura 1B). Como se observa en la Figura 1B, la fluorescencia verde de KikGR se convirtió completamente en roja dentro de la ROI. Tras el ensayo de fotoconversión, el embrión se retiró del agarosa y se crió a 28,5 °C en agua de huevo. Finalmente, el embrión se observó nuevamente 24 horas después de la fotoconversión, aproximadamente a las 72 hpf, para rastrear las células endoteliales fotoconvertidas en etapas posteriores (Figura 1C). Así, el embrión se incrustó nuevamente en LMA y la muestra se reescaneó utilizando los láseres de 488 nm y 561 nm. Como se muestra en la Figura 1C, en el tejido endotelial derivado de la ROI fotoconvertida, se observaron tanto proteínas KikGR no fotoconvertidas como fotoconvertidas, debido a la estabilidad de la KikGR fotoconvertida con fluorescencia roja y a la resíntesis de nueva KikGR verde no fotoconvertida.
Figura 1. Fotoconversión de KikGR durante el desarrollo del pez cebra. (A,B) Una región específica de la vasculatura endotelial de la cabeza fue fotoconvertida a las 48 hpf en embriones transgénicos Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 y (C) observada nuevamente 24 horas después de la fotoconversión (alrededor de las 72 hpf). Se muestran la fluorescencia de KikGR (verde), KikGR fotoconvertida (roja) y los canales combinados. Los círculos punteados indican la región de interés (ROI) antes, después y 24 horas posteriores a la fotoconversión. Las imágenes son vistas dorsales del embrión de pez cebra, con la parte anterior en la parte inferior. Barras de escala: 50 μm.
| Proteína (acrónimo) | Ex (nm) | Em (nm) | EC | RY | Estructura cuaternaria | Brillo | Aplicación | Ref |
| Kaede_G | 508 | 518 | 99 | 0.9 | tetramérico | 259 | Seguimiento celular | 2,6 |
| Kaede_R | 572 | 580 | 60 | 0.3 | tetramérico | 59 | ||
| KikGR_G | 507 | 517 | 54 | 0.7 | tetramérico | 112 | Seguimiento celular | 3,6,8-10 |
| KikGR_R | 583 | 593 | 35 | 0.6 | tetramérico | 68 | ||
| mKikGR_G | 505 | 515 | 49 | 0.7 | monomérico | 101 | Seguimiento dinámico Imágenes de superresolución | 13 |
| mKikGR_R | 580 | 591 | 28 | 0.6 | monomérico | 53 | ||
| EosFP_G | 506 | 516 | 72 | 0.7 | tetramérico | 150 | Seguimiento celular | 5,20 |
| EosFP_R | 571 | 581 | 41 | 0.5 | tetramérico | 67 | ||
| tdEos_G | 506 | 516 | 34 | 0.7 | dímero en tándem | 165 | Imágenes de superresolución | 12,14,21 |
| tdEos_R | 569 | 581 | 33 | 0.6 | dímero en tándem | 59 | ||
| mEos2_G | 506 | 519 | 56 | 0.7 | monomérico | 140 | Seguimiento dinámico Imágenes de superresolución | 11,18 |
| mEos2_R | 573 | 584 | 46 | 0.7 | monomérico | 90 | ||
| Dendra2_G | 490 | 507 | 45 | 0.5 | monomérico | 67 | Seguimiento dinámico Imágenes de superresolución | 4,11 |
| Dendra2_R | 553 | 573 | 35 | 0.55 | monomérico | 57 |
Tabla I. Propiedades de las proteínas fluorescentes fotoconvertibles. En la tabla se muestran, junto con el nombre común y/o acrónimo de cada PCFP, las longitudes de onda máximas de excitación (Ex) y emisión (Em), los coeficientes de extinción molar (EC, 10-3 M-1 cm-1), el rendimiento cuántico (QY), la estructura cuaternaria fisiológicamente relevante, el brillo relativo (como porcentaje del EGFP), la aplicación y las referencias. Tabla adaptada de Day y Davidson, 20101.
| PCFP | Líneas transgénicas de pez cebra | Origen |
| Kaede | Tg(elavl3:Kaede)rw0130a | Okamoto Lab |
| Tg(EPV.TP1-Mmu.Hbb:Kaede) | ||
| Tg(ins:Kaede) | ||
| Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede) | ||
| Tg(lhx5:Kaede)b1204/+ | ZIRC | |
| Tg(myl7:kaede) | ||
| Tg(olig2:Kaede) | ||
| Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t | ZIRC | |
| Tg(UAS:Kaede)rk8 | ZIRC | |
| Tg(vsx2:Kaede)nns2 | Higashijima Lab | |
| KikGR | Tg(kdrl:nlsKikGR) | |
| Tg(krt4:NTR-KikGR) | ||
| Tg(myl7:nlsKikGR) | ||
| Tg(sox10:KikGR) | ||
| Tg(UAS:KikGR) | ||
| EosFP | Tg(sox10:EosFP) | |
| Tg(sox10:nlsEosFP) | ||
| Dendra | Tg(-8mpx:Dendra2) | |
| Tg(UAS:Dendra-kras) |
Tabla II. Líneas transgénicas de pez cebra que expresan PCFPs. Datos obtenidos en la Base de Datos de Organismos Modelo Pez Cebra (ZFIN, http://zfin.org/). Se indica la disponibilidad de las líneas en el Centro Internacional de Recursos del Pez Cebra (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/).
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Discusión
En los últimos años, se han generado modelos animales transgénicos para la expresión de proteínas fotocambiables como Kaede o KikGR. Estos animales se desarrollan normalmente, lo que indica que estas proteínas no tienen efectos tóxicos sobre el desarrollo embrionario. El primer informe sobre un ensayo de fotocambio para el seguimiento de células en embriones animales fue realizado por Hatta y colaboradores mediante la inyección de ARNm o ADN que codifica Kaede en embriones de pez cebra de una sola célula para una expresi...
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Divulgaciones
No se declararon conflictos de intereses.
Agradecimientos
Agradecemos al Dr. Ian C. Scott por proporcionar amablemente la línea transgénica de pez cebra Tg(kdrl:nlsKikGR)hsc7 en el Hospital para Niños Enfermos de Toronto, Canadá. Agradecemos a la Instalación Central de Microscopía Confocal y de Dos Fotones (Centro Max-Delbrück para la Medicina Molecular) y al Dr. Zoltan Cseresnyes por la excelente asistencia técnica y el apoyo general en imágenes. S.A.-S. cuenta con una beca Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabajo fue financiado por la subvención DFG SE2016/7-1.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Materiales: | |||
| Equipo necesario para criar peces y recolectar huevos (véase el Zebrafish Book22 para más detalles). | |||
| Micróscopio estereoscópico | Leica | Lecia MZ6 Stereomicroscope | Equipado con láser que opera a 488 nm |
| Micróscopio confocal de barrido láser | Zeiss | Zeiss LSM 710 NLO | equipado con láseres que operan a 488 nm, 561 nm y 405 nm |
| Bloque calefactor | |||
| Par de pinzas Dumont n.º 5 | |||
| Placa de cultivo con fondo de cubreobjetos de vidrio | MatTek Corp | Ashland MA USA | |
| Puntas de micropipeta Microloader | Eppendorf | ||
| Vórtex | |||
| Agujas | |||
| Reactivos: | |||
| Medio de agua para huevos | |||
| 60 μg/ml de sales marinas Instant Ocean en ddH2O | |||
| Medio E3 | |||
| 5 mM NaCl | |||
| 0,17 mM KCl | |||
| 0,33 mM CaCl2 | |||
| 0,33 mM MgSO4 | |||
| 0,00001% (p/v) Azul de metileno | |||
| Solución stock de Tricaina 4 mg/ml | |||
| 400 mg de Tricaina (etiléster del ácido 3-amino benzoico) | Sigma-Aldrich | ||
| 97,9 ml de ddH2O | |||
| 2,1 ml de Tris 1 M (pH 9) | |||
| Ajustar a pH 7, alícuotas y almacenar a -20 °C | |||
| Agarosa de baja temperatura de fusión (LMA, Lonza) al 1% | |||
| 1 g de LMA/100 ml de medio E3 1X | |||
| Alícuotas y almacenar a 4 °C |
Referencias
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