Celular seguimiento mediante fotoconvertible proteínas durante el desarrollo de pez cebra

Resumen

Aquí, presentamos un método para el cambio fotoactivado de proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFPs) en el embrión vivo de pez cebra y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida en puntos de tiempo específicos durante el desarrollo. Esta metodología permite el seguimiento de los eventos biológicos celulares que subyacen a diferentes procesos de desarrollo en un organismo vertebrado vivo.

Resumen

La embriogénesis es un proceso dinámico que se estudia mejor mediante el uso de técnicas que permiten la documentación de los cambios en el desarrollo in vivo. El uso de proteínas fluorescentes codificadas genéticamente ha demostrado ser una estrategia valiosa para dilucidar los procesos morfogenéticos dinámicos a medida que ocurren en el organismo intacto. Durante la última década, el desarrollo de proteínas fluorescentes fotoactivables y fotoconvertibles ha abierto la posibilidad de investigar el destino de subpoblaciones discretas de proteínas marcadas¹. A diferencia de las proteínas fotoactivables, las proteínas fluorescentes fotoconvertibles (PCFP) se rastrean fácilmente y se obtienen imágenes en su estado de emisión nativo antes de la fotoconversión, lo que facilita la identificación y selección de regiones mediante inspección óptica. Los PCFP, como Kaede², KikGR³, Dendra⁴ y EosFP⁵, pueden cambiar de verde a rojo tras la exposición a la luz ultravioleta o azul debido a una secuencia de tripéptido de His-Tyr-Gly que forma un cromóforo verde que puede ser fotoconvertido a uno rojo mediante una eliminación de β catalizada por la luz y la posterior extensión de un sistema conjugado en π³. Los PCFP y sus variantes monoméricas son herramientas útiles para el seguimiento de las células^6-10 y el estudio de la dinámica de las proteínas^11-14, respectivamente. Durante los últimos años, los PCFPs se han expresado en diferentes modelos animales, como el pez cebra⁶, el pollo^7,8 y el ratón^9,10 para el seguimiento del destino celular. Aquí reportamos un protocolo para la fotoconversión celular específica de PCFPs en el embrión vivo de pez cebra y un seguimiento adicional de las proteínas fotoconvertidas en etapas posteriores del desarrollo. Esta metodología permite estudiar, de manera específica de tejidos, los eventos biológicos celulares que subyacen a la morfogénesis en el modelo animal de pez cebra.

Protocolo

1. Obtención de embriones para el ensayo de fotoconversión

Tras el cruzamiento interno de peces cebra transgénicos que expresan un PCFP, se eligen los embriones más brillantes, que son homocigotos, y se cultivan a 28,5 °C hasta la etapa embrionaria deseada¹⁵.

Nota 1: Esta preselección permitirá escanear embriones con baja potencia láser, evitando así la fototoxicidad y el fotoblanqueo.

Nota 2: Sugerimos utilizar luz de baja intensidad al visualizar embriones y mantenerlos en condiciones de oscuridad debido a la alta sensibilidad de los PCFP, como Kaede y KikGR, a la exposición a la luz, incluida la luz del día.

2. Incrustación

1. En un recipiente de vidrio con agua de huevo, descorionar embriones bajo microscopio estereoscópico con pinzas.
2. Anestesiar embriones transfiriendo un embrión decorionado a una solución de 0,16 mg/ml de tricaína (3-aminoácidos ácido benzoicoetílico, Sigma-Aldrich) (40 μl de solución madre de 4 mg/ml en 1 ml de medio E3 1X).

Nota 1: Transfiera los embriones con una pipeta de vidrio o una punta cortada (P1000) para minimizar el riesgo de dañar los embriones.

Nota 2: Los embriones jóvenes decorionados no deben exponerse al aire ni elevarse a la interfaz agua/aire, ya que los óvulos se rompen fácilmente cuando se someten a estrés mecánico.

3. Transfiera el embrión anestesiado a la cubierta de una placa de cultivo y mantenga el embrión dentro del menor volumen posible de medio.
4. Transfiera el embrión a agarosa pipeteando el embrión con agarosa al 1% a baja temperatura de fusión (LMA, Lonza) a 30 °C que contenga 0,16 mg/ml de tricaína, y colóquelo en el cubreobjetos de una placa de cultivo con fondo de cubreobjetos (MatTek Corp. Ashland MA USA). A continuación, orientar el embrión con la ayuda de una punta de plástico lisa (por ejemplo, una punta de pipeta de microcargador cortada, Eppendorf) y, cuando el LMA se haya polimerizado, cubrir la agarosa con una solución de tricaína de 0,16 mg/ml.

Nota 1: Derretir 1% de LMA a 60 °C y mantener la agarosa fundida a 30 °C.

3. Fotoconversión

1. En un microscopio confocal invertido equipado con una fuente láser de 405 nm, 488 nm y 561 nm, como el Zeiss LSM 710, visualice la muestra mediante un escaneo z-Stack que cubre toda la estructura de la muestra que se va a fotoconvertir y se rastreará posteriormente utilizando el láser de 488 nm (es decir, láser Ar de 30 mW, a una intensidad del 5-7 %, detector configurado a 493-540 nm) y el láser de 561 nm (es decir, láser de 561 nm., láser DPSS 561 de 10 mW, a una intensidad del 7-9 %, detector ajustado a 587-651) para escanear el tejido/órgano en busca de la fluorescencia verde y roja de las proteínas fotoconvertibles, respectivamente.

Nota 1: Para el escaneo antes de la fotoconversión, utilizamos un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Nota 2: Siempre busque la fluorescencia roja antes del experimento para excluir la presencia de cualquier PCFP convertido en rojo generado accidentalmente.

2. Seleccione la herramienta Serie temporal y configúrela para 2 ciclos sin intervalo (uno para la preconversión y otro para la fotoconversión posterior).
3. Seleccione la herramienta Regiones y defina una o más regiones de interés (ROI) para la fotoconversión.

Nota 1: Recomendamos determinar primero la precisión con la que la región realmente fotoconvertida por el láser de escaneo en el ROI coincide con el ROI seleccionado en el software midiendo el área de tejido/células fotoconvertidas en las tres (dirección xy y z) en una muestra fija donde no se espera ningún movimiento de células o proteínas. Para los ajustes descritos en esta aplicación, el ROI coincidió con la región fotoconvertida con gran precisión, pero esto depende del objetivo utilizado y de la cantidad de láser aplicada para la fotoconversión. El tamaño del ROI se puede reducir al tamaño de una sola celda dependiendo de la apertura numérica del objetivo, el factor de zoom y la cantidad de luz láser utilizada para la fotoconversión.

4. Seleccione la herramienta Blanqueo y configúrela para comenzar a blanquear después del escaneo 1 de 2. Utilizamos un láser de diodo de 30 mW y 405 nm para la fotoconversión y lo optimizamos cuidadosamente para la cantidad mínima de luz láser necesaria para la fotoconversión completa, que se logra principalmente variando la intensidad de la luz láser, las iteraciones de escaneo del ROI y el tiempo de píxel (es decir, la velocidad de escaneo).

Nota 1: Para la fotoconversión utilizamos un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Nota 2: La potencia del láser y el número de iteraciones deben determinarse empíricamente para cada entorno experimental y deben garantizar la fotoconversión completa de PCFP verde a rojo dentro del ROI con la cantidad mínima necesaria de luz láser para reducir la fototoxicidad. Recomendamos iniciar las pruebas utilizando una potencia láser baja (por ejemplo, 3 %, correspondiente a 0,03 mW en el plan objetivo) combinada con un número bajo de iteraciones (por ejemplo, 20), y aumentar posteriormente la potencia del láser hasta lograr la fotoconversión completa, que en nuestras manos estaba al 10 % de potencia láser (correspondiente a 0,1 mW en el plan objetivo). En estas condiciones, todos los embriones analizados sobrevivieron al plan de tratamiento. Sin embargo, observamos que la membrana vitelino es sensible a los pulsos de láser y puede dañarse fácilmente causando la muerte del embrión. Por esta razón, la letalidad del embrión después de la fotoconversión puede ser causada si la posición del tejido objetivo está cerca del cuerpo de la yema.

5. Escanee la muestra con una pila z utilizando láseres de 488 nm y 561 nm para visualizar cualquier verde restante y la fluorescencia roja fotoconvertida del PCFP.

Nota 1: Para el escaneo después de la fotoconversión, utilizamos un Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

4. Eliminar el embrión de la agarosa

1. Deseche la solución y extraiga con cuidado el embrión de la LMA al 1% con la ayuda de una aguja o una punta de plástico lisa.
2. Mantener el embrión en agua de huevo en la oscuridad a 28,5 °C hasta la etapa de desarrollo deseada.

Nota 1: Es importante que los embriones continúen su desarrollo en el agua de huevo, particularmente durante los primeros días de desarrollo durante la extensión del cuerpo embrionario. De hecho, algunos tejidos/órganos embrionarios cambian de posición durante el desarrollo y, por lo tanto, requieren orientaciones específicas durante la incrustación, lo que depende del tejido/órgano particular de interés y de la etapa de desarrollo deseada del análisis.

5. Reincrustación

1. Proceda como se indica en el punto 2.) de este protocolo.

6. Seguimiento de tejido fotoconvertido en etapas embrionarias posteriores

1. Escaneo de la región de interés (z-Stack) utilizando láseres para señales fluorescentes de 488 nm y 561 nm para señales fluorescentes verde y roja, respectivamente.

Nota 1: Para el escaneo x horas después de la fotoconversión, utilizamos un Plan Apochromat 20x/NA 0.8.

Nota 2: Dado que este protocolo no afecta al desarrollo normal del embrión, es posible observar el embrión fotoconvertido en etapas posteriores de desarrollo (para ello, proceda como se indica en los puntos 4 - 6).

7. Resultados representativos

En la Figura 1 se muestra un ejemplo de un ensayo de fotoconversión. Rastreamos las células endoteliales durante el desarrollo del pez cebra (para una revisión de la anatomía vascular del pez cebra en desarrollo, ver¹⁶). En consecuencia, utilizamos una línea reportera de pez cebra Tg(kdrl:nlsKikGR)^hsc7 que expresa KikGR dentro de los núcleos endoteliales¹⁷. Los embriones homocigotos y de expresión brillante se criaron a 28,5 °C hasta 48 horas después de la fertilización (hpf). Tras la decorionación, los embriones se anestesiaron y se incrustaron en LMA colocando el lado anterior-dorsal del embrión hacia el cubreobjetos para una mejor visualización de los vasos de la cabeza. Utilizamos un microscopio confocal invertido (Zeiss LSM 710 Meta) equipado con láseres que funcionan a 405 nm, 488 nm y 561 nm, y un objetivo Plan Apochromat 20x/NA 0.8 para el ensayo de fotoconversión y el seguimiento posterior de la proteína fotoconvertida. Como se muestra en la Figura 1A, antes de la fotoconversión, KikGR se expresaba dentro del tejido endotelial y solo era detectable como fluorescencia verde utilizando un láser de argón de 488 nm. Los escaneos de control con un láser DPSS 561-10 de 561 nm para fluorescencia roja no detectaron ningún KikGR fotoconvertido antes de la fotoconversión (Figura 1A). Posteriormente, el ROI se fotoconvirtió completamente utilizando un láser de diodo de 405 nm (a una intensidad del 10%, 20 iteraciones) y los vasos de cabeza se escanearon nuevamente utilizando los láseres de 488 nm y 561 nm (Figura 1B). Como se muestra en la Figura 1B, el KikGR verde había cambiado completamente a rojo dentro del ROI. Después del ensayo de fotoconversión, el embrión se extrajo de la agarosa y se crió a 28,5 °C en agua de huevo. Finalmente, el embrión se observó de nuevo 24 horas después de la fotoconversión, alrededor de 72 hpf, para rastrear las células endoteliales fotoconvertidas en etapas posteriores (Figura 1C). Por lo tanto, el embrión se incrustó en LMA y la muestra se volvió a escanear utilizando los láseres de 488 nm y 561 nm. Como se muestra en la Figura 1C, dentro del tejido endotelial que surge del ROI fotoconvertido, se observaron proteínas KikGR no fotorconvertidas y fotorconvertidas debido a la estabilidad del KikGR fotorreformado fluorescente rojo y la resíntesis de nuevos KikGR verdes no fotoconvertidos.

Figura 1. Fotoconversión de KikGR durante el desarrollo del pez cebra. (A,B) Una región específica de la vasculatura de la cabeza endotelial se fotoconvirtió a 48 hpf en embriones transgénicos Tg(kdrl:nlsKikGR)^hsc7 y (C) se observó nuevamente 24 horas después de la fotoconversión (alrededor de 72 hpf). Se muestra la fluorescencia de KikGR (verde), KikGR fotoconvertido (rojo) y canales fusionados. Los círculos punteados muestran el ROI antes, después y 24 horas después de la fotoconversión. Las imágenes son vistas dorsales del embrión de pez cebra, anterior a la parte inferior. Barras de escala: 50 μm.

Proteína (Acrónimo)	Ex (nm)	Em (nm)	EC	Qy	Estructura cuaternaria	brillo	aplicación	Ref
Kaede_G	508	518	99	0.9	tetrámero	Artículo 259	Seguimiento de celdas	2,6
Kaede_R	572	580	60	0.3	tetrámero	59
KikGR_G	507	517	54	0.7	tetrámero	Artículo 112	Seguimiento de celdas	3,6,8-10
KikGR_R	583	Artículo 593	35	0.6	tetrámero	Artículo 68
mKikGR_G	505	515	49	0.7	monómero	Artículo 101	Seguimiento dinámico Imágenes de superresolución	13
mKikGR_R	580	591	28	0.6	monómero	53
EosFP_G	506	516	72	0.7	tetrámero	150	Seguimiento de celdas	5,20
EosFP_R	571	581	41	0.5	tetrámero	Artículo 67
tdEos_G	506	516	34	0.7	dímero en tándem	165	Imágenes de superresolución	12,14,21
tdEos_R	Artículo 569	581	33	0.6	dímero en tándem	59
mEos2_G	506	519	56	0.7	monómero	140	Seguimiento dinámico Imágenes de superresolución	11,18
mEos2_R	573	584	46	0.7	monómero	90
Dendra2_G	490	507	45	0.5	monómero	Artículo 67	Seguimiento dinámico Imágenes de superresolución	4,11
Dendra2_R	553	573	35	0.55	monómero	57

Tabla I. Propiedades de las proteínas fluorescentes fotoconvertibles. Junto con el nombre común y/o acrónimo de cada PCFP, en la tabla se muestran las longitudes de onda de excitación máxima (Ex) y emisión (Em), los coeficientes de extinción molar (EC, 10-3 M-1 cm-1), el rendimiento cuántico (QY), la estructura cuaternaria fisiológicamente relevante, el brillo relativo (como % de EGFP), la aplicación y las referencias. Tabla adaptada de Day y Davidson, 2010¹.

PCFP	Líneas transgénicas de pez cebra	fuente
Kaede	Tg(elavl3:Kaede)rw0130a	Laboratorio Okamoto
	Tg(EPV. TP1-Mmu.Hbb:Kaede)
	Tg(ins:Kaede)
	Tg(isl1:Gal4-VP16,14xUAS:Kaede)
	Tg(lhx5:Kaede)b1204/+	ZIRC
	Tg(myl7:kaede)
	Tg(olig2:Kaede)
	Tg(UAS-E1b:Kaede)s1999t	ZIRC
	Tg (UAS: Kaede) rk8	ZIRC
	Tg(vsx2:Kaede)nns2	Laboratorio de Higashijima
KikGR	Tg(kdrl:nlsKikGR)
	Tg(krt4:NTR-KikGR)
	Tg(myl7:nlsKikGR)
	Tg(sox10:KikGR)
	Tg (UAS: KikGR)
EosFP	Tg(sox10:EosFP)
	Tg(sox10:nlsEosFP)
Dendra	Tg (-8mpx: Dendra2)
	Tg (UAS: Dendra-kras)

Tabla II. Líneas transgénicas de pez cebra que expresan PCFPs. Datos obtenidos en la Base de Datos de Organismos Modelo de Pez Cebra (ZFIN, http://zfin.org/). Se indica la disponibilidad de líneas en el Centro Internacional de Recursos para el Pez Cebra (ZIRC, http://zebrafish.org/zirc/).

Discusión

En los últimos años se han generado modelos animales transgénicos para la expresión de proteínas fotoconvertibles como Kaede o KikGR. Estos animales se desarrollan normalmente, lo que indica que estas proteínas no tienen efectos tóxicos sobre el desarrollo embrionario. El primer informe sobre un ensayo de fotoconversión para el seguimiento de células en embriones animales fue realizado por Hatta y sus colaboradores mediante la inyección de ARNm o ADN que codifica Kaede en embriones de pez cebra unicelulares para su expre...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Materiales:
Equipo necesario para la cría de peces y la recolección de huevos (ver el Libro del Pez Cebra22 para más detalles).
Microscopio estereoscópico	Leica	Lecia MZ6	Equipado con láser que funciona a 488 nm
Microscopio de barrido láser confocal	Zeiss	Zeiss LSM 710 NLO	equipado con láseres que funcionan a 488 nm, 561 nm y 405 nm
Bloque
Par de pinzas
Plato de cultivo con fondo de vidrio MatTek	Corp		Ashland MA USA
Microloader Pipeta Tips	Eppendorf
Vortex
needles
Reactivos:
Egg water medium
60 μ g/ml Sales marinas oceánicas instantáneas en ddH2O
E3 medio
5 mM NaCl
0,17 mM KCl
0,33 mM CaCl2
0,33 mM MgSO4
0,00001% (c/v) Azul de metileno
4 mg/ml solución madre de tricaína
400 mg Tricaína (ácido benzoico de 3 aminoácidosetílico)	Sigma-Aldrich
97.9 ml ddH2O
2.1 ml 1M Tris (pH9)
Ajustar a pH 7, alícuota y almacenar -20 ° C
1% LMA (Agarosa a baja temperatura de fusión, Lonza)
1g LMA/100 ml E3 medio 1X
Alícuota y almacenar a 4 ° C