Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Las nanopartículas virales para

17K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/4352

⸱

16 de noviembre de 2012

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University , 2Department of Biomedical Engineering, Radiology, and Materials Science and Engineering, Case Western Reserve University

En este artículo

Resumen

Nanopartículas de plantas virales (VNPs) son prometedoras plataformas para aplicaciones en biomedicina. A continuación, se describen los procedimientos para la propagación de plantas VNP, purificación, caracterización y bioconjugación. Finalmente, mostramos la aplicación de VNPs para la recalada del tumor y la formación de imágenes mediante un modelo de xenotrasplante de ratón y de imágenes de fluorescencia.

Resumen

El uso de nanomateriales tiene el potencial de revolucionar la medicina y ciencia de los materiales. Actualmente, un número de diferentes nanopartículas están siendo investigados para aplicaciones en la formación de imágenes y terapia. Nanopartículas virales (VNPs) derivados de plantas pueden ser considerados como auto-ensambladas bionanomaterials con tamaños definidos y formas. Los virus de plantas bajo investigación en el laboratorio de Steinmetz incluyen partículas icosaédricas formadas por virus del mosaico del caupí (CPMV) y el virus del mosaico de Brome (BMV), ambos de los cuales son 30 nm de diámetro. También estamos desarrollando estructuras en forma de varilla y filamentosas derivados de los virus de las plantas siguientes: virus del mosaico del tabaco (TMV), que forma varillas rígidas con unas dimensiones de 300 nm por 18 nm, y Potato virus X (PVX), que forman partículas filamentosas 515 nm de longitud y 13 nm de ancho (se remite al lector a las refs. 1 y 2 para obtener más información sobre VNPs).

en planta, son excepcionalmente estables, y biocompatible. También, VNPs son "programables" unidades, que pueden ser específicamente diseñados mediante modificación genética o métodos químicos bioconjugación 3. La estructura de VNPs se conoce a resolución atómica, y modificaciones pueden llevarse a cabo con precisión espacial a nivel atómico 4, un nivel de control que no se puede lograr utilizando nanomateriales sintéticos con estado actual de la técnica de las tecnologías.

En este trabajo se describe la propagación de CPMV, PVX, TMV, y la BMV en Vigna ungiuculata y plantas de Nicotiana benthamiana. Protocolos de extracción y purificación para cada VNP se dan. Métodos para la caracterización de purificado y VNPs químicamente marcados se describen. En este estudio, nos centramos en chetiquetado emical de VNPs con fluoróforos (por ejemplo, Alexa Fluor 647) y polietilenglicol (PEG). Los colorantes de facilitar el seguimiento y la detección de los VNPs 5-10, y PEG reduce la inmunogenicidad de las nanopartículas proteináceos al tiempo que mejora su farmacocinética 8,11. Demostramos tumor homing de VNPs PEGilados utilizando un modelo de ratón xenograft tumor. Una combinación de imágenes de fluorescencia de tejidos ex vivo mediante Maestro del sistema de imágenes, la cuantificación de fluorescencia en tejidos homogeneizados, y la microscopía confocal se utiliza para estudiar la biodistribución. VNPs se eliminan a través del sistema reticuloendotelial (RES); tumor homing se logra pasivamente a través del aumento de la permeabilidad y retención (EPR) efecto 12. La nanotecnología VNP es un potente plug-and-play de tecnología para el tratamiento de la imagen y sitios de la enfermedad in vivo. Seguimos desarrollando VNPs para llevar cargas de drogas y restos de formación de imágenes clínicamente relevantes, así como ligandos específicos de tejido aorientar receptores moleculares sobreexpresa en el cáncer y la enfermedad cardiovascular.

Protocolo

1. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Propagación

  1. Poner la cámara de planta de interior controla a 15 horas del día (100% de luz, 25 º C, 65% de humedad) y 9 h de la noche (0% de luz, 22 ° C, 60% de humedad).
  2. Se inoculan las plantas de acuerdo a la escala de tiempo en la Tabla 1.
CPMV PVX, TMV, y BMV
Día 0: Planta 3 caupí semillas / maceta. Día 0: Plant ~ 30 N. benthamiana semillas / maceta. Fertilizar una vez por semana con un fertilizante cucharada 1/5 l de agua.
Día 14: Re-pot N. benthamiana en 1 planta / maceta.
Día 10: Infect deja las hojas primarias con CPMV (5 μg/50 l / hoja) por inoculación mecánica con una fina capa de carburo de silicio. Día 28: Infect tres a five deja con PVX, TMV, o BMV (5 μg/50 l / hoja) por inoculación mecánica con una fina capa de carburo de silicio.
Día 20: Hojas de la cosecha y almacenar a -80 ° C. Día 42: las hojas de la cosecha y almacenar a -80 ° C.

Tabla 1. Cronograma para el cultivo, infectando, y cosechar las hojas.

Nota: sólo propagación CPMV se demuestra como un ejemplo.

2. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Purificación

Nota: Todos los pasos se llevan a cabo en hielo o a 4 º C.

  1. Homogeneizar 100 g de hojas congeladas en un mezclador estándar utilizando 2 volúmenes de tampón frío (véase la Tabla 2). Filtrar a través de 2-3 capas de estopilla.
  2. Para PVX, ajustar el pH a 6,5 ​​utilizando 1 M de HCl. Añadir 0,2% (w / v) de ácido ascórbico y 0,2% (w / v) de sodio sulfiTE.
  3. Centrifugar homogeneizado crudo planta a 5.500 xg durante 20 min. Recoger el sobrenadante.
  4. Para BMV, capa de 25 ml de sobrenadante sobre 5 ml de 10% (w / v) de solución de sacarosa. Se centrifuga a 9.000 xg durante 3 horas y se resuspende el pellet en solución de CsCl 38,5% (w / v). Mezclar por agitación durante 5 horas, y luego continúe con el paso 2.12.
  5. Extraer material de la planta mediante la adición de 0,7 volúmenes de 1:1 (v / v) de cloroformo :1-butanol. Revuelva la mezcla durante 30-60 min.
  6. Centrifugar la solución a 5.500 xg durante 20 min. Recoger la fase acuosa superior.
  7. Añadir NaCl a 0,2 M y 8% (w / v) PEG (MW 8.000). Para TMV, también añadir 1% (v / v) de Triton X-100. Se agita durante al menos 1 h, después se deja reposar durante al menos 1 h.
  8. Se centrifuga la solución a 15.000 xg durante 15 min. Resuspender el sedimento en 10 ml de tampón. Para PVX, añadir 0,1% β-mercaptoetanol y urea a 0,5 M.
  9. Centrifugar a 8.000 xg durante 30 min y recoger el líquido sobrenadante.
  10. Ultracentrífuga sobrenadante a 160.000 xg durante 3 hr. Resuspender el sedimento en 5 ml de tampón overnight.
  11. Preparar un gradiente de sacarosa al 10-40% usando volúmenes iguales de 10%, 20%, 30% y 40% de sacarosa en tampón (el más pesado primero). Permitir que el gradiente de equilibrar durante la noche a temperatura ambiente.
  12. Ultracentrífuga precipitado resuspendido sobre gradiente de sacarosa a 100.000 xg durante 2 horas (24 horas para BMV).
  13. Recoger banda de dispersión de luz y diálisis frente a tampón.
  14. Caracterizar los VNPs (abajo) y se almacena a 4 º C. Para almacenamiento a largo plazo, almacenar a -80 ° C.
CPMV y TMV 0,1 M de tampón de fosfato de potasio (pH 7,0)
38,5 mM KH 2 PO 4
61,5 mM K 2 HPO 4
PVX 0,5 M de tampón borato (pH 7,8)
0,5 M de ácido bórico
Ajustar el pH con NaOH
BMV SAMA tampón (pH 4,5)
250 mM de acetato de sodio
10 mM MgCl 2
2 mM β-mercaptoetanol (añadir nuevo)

Tabla 2. Buffers y sus recetas para cada VNP.

Nota: sólo propagación CPMV se demuestra como un ejemplo.

3. VNP (CPMV, BMV, PVX y TMV) Caracterización

  1. Espectroscopía UV / visible para determinar la concentración de VNPs.
    1. Medir la absorbancia de 2 l de muestra utilizando un espectrofotómetro NanoDrop.
    2. Determinar la concentración de partículas y colorantes utilizando la ley de Beer-Lambert (A εcl =, donde A es la absorbancia, ε es el coeficiente de extinción, c es la concentración, y l es la longitud del camino). La longitud del camino es de 0,1 cm para el NanoDrop.
      Los coeficientes de extinción VNP-específicos son:
      CPMV: 8,1 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      PVX: 2,97 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      TMV: 3,0 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
      BMV: 5,15 cm -1 mg -1 ml (a 260 nm)
  2. Analizar las partículas por exclusión de tamaño rápido cromatografía líquida de proteínas (FPLC).
    1. El uso de un Superose 6 columna de exclusión por tamaño y el Explorador de ÄKTA, carga de 50-100 g de VNPs en 200 l de 0,1 M tampón fosfato de potasio (pH 7,0).
    2. Establecer detectores a 260 nm (ácido nucleico), 280 nm (proteína), y la longitud de onda de excitación de los colorantes unidos.
    3. Ejecute a una velocidad de flujo de 0,5 ml / min durante 72 min.
    4. El perfil de elución y A260: A280 nm indica si la preparación VNP es puro y si las partículas están intactos y montados.
      El siguiente A260: 280 proporciones indican una preparación pura VNP:
      CPMV: 1,8 ± 0,1
      PVX: 1,2 ± 0,1
      TMV:1,1 ± 0,1
      BMV: 1,7 ± ​​0,1
  3. Realizar desnaturalización (pre-cast NuPAGE) Bis-Tris poliacrilamida 4-12% electroforesis en gel de gradiente para analizar la pureza de la preparación y la conjugación a proteínas de recubrimiento individuales.
    1. Añadir 3 ml de tampón de muestra LDS 4x a 10 g de las partículas en 9 l de tampón de fosfato de potasio. Añadir un adicional de 1 l de tampón de muestra LDS 4x y 3 l de β-mercaptoetanol a BMV para reducir el elevado número de enlaces disulfuro.
    2. Incubar en bloque de calor durante 5 minutos a 100 ° C.
    3. Cargar muestras en un gel de SDS.
    4. Ejecutar las muestras a 200 V durante 1 h en 1x MOPS funcionamiento de amortiguación.
    5. Documentar el gel bajo luz UV para visualizar las proteínas fluorescentes abrigo.
    6. Para no fluorescente de proteínas, tinción con azul de Coomassie (0,25% (w / v) azul brillante de Coomassie R-250, 30% (v / v) de metanol, 10% (v / v) de ácido acético) durante 1 hr.
    7. Destain con 30% de metanol, 10% de ácido acético durante la noche. Change la solución si se requiere.
    8. Documentar el gel con luz blanca.
  4. Analizar la integridad de las partículas por microscopía electrónica de transmisión (TEM).
    1. Diluir las muestras a 0.1-1 mg / ml en 20 l de agua DI.
    2. Coloque 20 gotas l de las muestras en Parafilm.
    3. Cubra gotas con una rejilla TEM y deje reposar durante 2 min. Wick fuera de la solución en exceso en la rejilla con papel de filtro.
    4. Lave la red mediante la colocación de una gota de agua DI luego mecha seca.
    5. Mancha de red mediante la colocación de una gota en 20 l de 2% (w / v) de acetato de uranilo durante 2 min. Wick fuera el exceso de tinción con papel de filtro.
    6. Lavar rejilla una vez más en agua.
    7. Observe red con un microscopio electrónico de transmisión.

4. Conjugación química de VNPs con PEG y fluoróforos, purificación y caracterización

  1. Para los cálculos para las reacciones siguientes, la masa molar de los VNPs son:
    CPMV: 5,6x 10 6 g / mol
    PVX: 35 x 10 6 g / mol
    TMV: 41 x 10 6 g / mol
    BMV: 4,6 x 10 6 g / mol
  2. Conjugar tintes y PEG a las lisinas superficiales de CPMV y PVX utilizando un solo paso N-hidroxi succinimida reacción de acoplamiento: Añadir 2.500 equivalentes molares (todos los excesos molares se refieren a un exceso molar de por VNP) de Alexa Fluor 647 éster de succinimidilo y 4.500 equivalentes de NHS- PEG (PM 5.000) disuelto en DMSO a CPMV en 0,1 M tampón fosfato de potasio. Cuando se trabaja con PVX, añadir un exceso molar de 10.000 NHS-dye y PEG-NHS. Ajustar los volúmenes de tampón y DMSO tales que la concentración final de CPMV y PVX es 2 mg / ml y el contenido de DMSO es 10% del volumen total de reacción. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a temperatura ambiente protegido de la luz. CPMV y PVX tiene 300 y 1.270 lisinas direccionables, respectivamente. (El lector puede consultar las siguientes referencias para lecturas adicionales sobremodificación química de CPMV y PVX: 13-15).
  3. Colorantes conjugado y PEG a tirosinas del TMV mediante un acoplamiento de diazonio seguido por el cobre (I)-catalizada azida-alquino cicloadición.
    1. Preparar sal de diazonio (alquino) mediante la mezcla de 400 l de 0,3 M de monohidrato de ácido p-toluenosulfónico, 25 l de nitrito de sodio 3,0 M, y 75 l de 0,68 M destilada 3-etinilanilina disolvió en acetonitrilo a 4 º C durante 1 hr.
    2. Añadir 3,3 ml de tampón borato, pH 8,8, que contiene 100 mM NaCl a 1,25 ml de TMV (20 mg / ml de solución madre).
    3. Reaccionar el TMV con 450 l de la sal de diazonio (alquino) de solución en un baño de hielo durante 3 horas para añadir una ligadura alquino manejar a TMV por acoplamiento de diazonio. La solución se convertirá en un color marrón claro. TMV tiene 2.140 tirosinas disponibles para la conjugación.
    4. Se purifica el producto final utilizando un colchón de sacarosa como se describe en el paso 4,4.
    5. Adjuntar azida-funcional Alexa Fluor 647 y PEG-azida (PM 5.000) using de cobre (I)-catalizada azida-alquino cicloadición (CuAAC). Añadir 2 equivalentes de tinte y PEG-azida por proteína de la cubierta y se incuban con 1 mM CuSO 4, 2 mM AMG, y ascorbato de sodio 2 mM a temperatura ambiente durante 15 min. Ajustar el volumen del tampón de forma que la concentración final de reacción de TMV es 2 mg / ml. (El lector puede consultar las siguientes referencias para la lectura adicional sobre la modificación química de TMV: 16,17).
  4. Conjugar colorantes a lisinas y PEG a cisteínas de cisteína BMV mutante (cBMV):
    1. Añadir 2.000 equivalentes molares de Oregon Green 488 succinimidil éster disueltos en DMSO a cBMV en 0,1 M de tampón TNKM (50 mM Tris base, 50 mM NaCl, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2, pH 7,4). Ajustar los volúmenes de tampón y DMSO tales que la concentración final de BMV es 1 mg / ml y el contenido de DMSO es 10% del volumen total de reacción. Incubar la mezcla de reacción durante la noche a 4 º C protegida de la luz.
    2. Purificar las partículas mediante centrifiltros fugados como se describe en el paso 4.4.
    3. Añadir 2.000 exceso molar de PEG-maleimida (PM 2.000) usando las mismas condiciones de reacción como antes y se incuba la mezcla de reacción durante 2 horas a 4 ° C. cBMV tiene 180 lisinas reactivas y cisteína. (El lector puede consultar las siguientes referencias para la lectura adicional sobre la modificación química de la BMV, 18).
  5. Purificación: Pasar la solución a través de un colchón de sacarosa al 40% (w / v) a 160.000 xg durante 2,5 hr. Volver a disolver el precipitado en tampón. Alternativamente, se dializa frente a tampón apropiada, usando 10 kDa de corte filtros spin.
  6. Caracterización: VNPs PEGilados y marcado fluorescentemente-se analizaron usando los métodos descritos anteriormente: UV / visible de espectroscopia, la electroforesis en gel de SDS, FPLC, y TEM (no se muestra, sin embargo, se refieren a las figuras 6 y 7).

5. Tumor de Metas e imágenes utilizando un modelo de xenoinjertos de ratón

  1. Cultura HT-29 células humanas de cáncer de colon en medio RPMI suplementado con FBS al 5%, 1% de penicilina-estreptomicina, y 1% de L-glutamina, a 37 ° C en 5% de CO 2 utilizando 175 cm 2 frascos de cultivo celular.
  2. Lavar las células dos veces con PBS estéril y la cosecha mediante la incubación con 5 ml de tripsina-EDTA a 37 º C durante 5 min. Inactivar la tripsina con 5 ml de medio RPMI. Recoger las células por centrifugación a 500 xg durante 5 min. a 4 º C y se resuspende en medio fresco RPMI a 5x10 6 células/50 medio l (determinar recuento total de células usando azul de tripano y un hemocitómetro a). Mezclar con un volumen igual de matrigel antes de la inyección (mantener todas las soluciones y reactivos estériles).
  3. Adquirir seis semanas de edad NCR nu / nu ratones y los mantienen en una dieta libre de alfalfa durante 2 semanas. [Nota:. Todos los procedimientos con animales debe ser aprobado por el IACUC] Inducir xenoinjertos de tumores mediante inyección subcutánea de 5x10 6 células/100 l / tumor en los flancos (2 tumores / ratón) usando un manómetro 18 1/2 estérilaguja. Monitorear los animales regularmente. Medir el tamaño del tumor usando calibres y permitir que los tumores crezcan a un volumen promedio de 20 mm 3 (dentro de los próximos 12 días). Asignar los ratones en dos grupos al azar: PBS y VNP (n = 3 animales / grupo / hora punta). Uso de un 1 ml jeringa de insulina de calibre 28, administrar por la vena de la cola de inyección intravenosa 100 l de PBS estéril o 10 mg / kg formulación VNP.

Nota: los experimentos de cultivo de tejidos y estudios con animales vivos que no se ha demostrado. Demostración práctica se limitará a procesamiento de tejidos y de adquisición de datos. Para una referencia sobre la HT-29 modelo de xenoinjerto de tumor, se remite al lector a la ref. 19

Tres técnicas se utilizan para evaluar el tumor homing de VNPs:

  1. Imágenes de fluorescencia mediante Maestro Imaging System: ratones sacrificio en diferentes puntos de tiempo (2, 24, y 72 h) usando CO 2gas. Disecar los animales y especiales todos los órganos principales (cerebro, corazón, pulmones, el bazo, los riñones y el hígado), junto con los tumores en los flancos, colocar los tejidos en parafilm, y analizar con el instrumento de formación de imágenes de fluorescencia utilizando excitación amarillo y filtros de emisión (800 ms exposición) para detectar la presencia de señales fluorescentes en los tejidos (derivadas de A647 etiqueta conjugarse a los VNPs). Guarde las imágenes y analizar la intensidad de fluorescencia utilizando ImageJ software 1.44o ( http://imagej.nih.gov/ij ). Comparar el patrón de absorción de los VNPs en los tumores con otros tejidos importantes con el tiempo.
  2. Después de la imagen, recortar cada tejido por la mitad e insertar un medio en compuesto OCT para el análisis de la crio-seccionamiento y confocal. Recoge la otra mitad en predosificados crio-viales y congelar inmediatamente utilizando N2 líquido. Almacenar a -80 ° C hasta que esté listo para su posterior procesamiento.
  3. Fluorescencia de cuantificación: Retejidos de la médula pesos. Descongelar los tejidos congelados a temperatura ambiente y colocarlos en tubos separados Falcon de 50 ml que contienen 1 ml de PBS. El uso de un homogeneizador de tejidos de mano, homogeneizar los tejidos para 2-3 min en PBS a continuación, transferir el homogenado a tubos de microcentrífuga. Se centrifuga el homogeneizado durante 10 min a 13.000 xg para eliminar la no-tejido homogeneizado.
  4. Pipetear 100 l del sobrenadante de los tejidos de cada grupo (formulaciones PBS y VNP / puntos de tiempo) en una placa de UV 384 y negro. Evaluar la intensidad de fluorescencia (Ex / Em longitudes de onda de 600/665), utilizando un lector de placas. Normalizar los valores obtenidos fluorescentes por los pesos de los tejidos.
  5. Inmunohistoquímica: Preparar la crio-micrótomo secciones (10 micras) y se almacena a -20 ° C. Mancha de las secciones de tejido para núcleos de las células (DAPI) y marcador de células endoteliales (marcado con FITC anti-ratón CD31 de anticuerpos). Llevar a cabo el análisis por microscopía confocal para mapear la localización intra vascular y tumoral de marcado fluorescentemente VNPs.

Nota: Este procedimiento no se ha demostrado, los datos representativos se muestran en la Figura 8. Para una referencia sobre la inmunohistoquímica y los métodos de tinción descritos, se remite al lector a la ref. 19

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

Análisis comparativo del crecimiento vegetal; configuración experimental, estudio de la variación del color de las hojas, método de clorosis.
Figura 1. Plantas infectadas con virus vegetales. Plantas de Vigna unguiculata infectadas con CPMV (A). Plantas de Nicotiana benthamiana infectadas con PVX (B), TMV (C) y BMV (D). Las imágenes se to...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

Este protocolo proporciona un método para la modificación química de VNPs y sus aplicaciones para la formación de imágenes de tumores in vivo. Las técnicas de formación de imágenes de fluorescencia de animales, la cuantificación de fluorescencia, y la inmunohistoquímica presentados aquí son útiles para el estudio de biodistribución y la evaluación de tumor homing. Estas técnicas proporcionan información valiosa con respecto al acceso de las nanopartículas en el tumor por el efecto EPR. Mediante la comb...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el NIH / NIBIB subvenciones R00 EB009105 (para NFS) y EB011317 P30 (para NFS), un NIH / NIBIB formación de subvención T32 EB007509 (a AMW), un Case Western Reserve University Interdisciplinario Alliance Investment Grant (para NFS), y Un Caso Comprehensive Cancer Center subvención P30 CA043703 (para NFS). Agradecemos a los investigadores de laboratorio Steinmetz pregrado de estudiantes para sus prácticas en el apoyo: Nadia Ayat, Kevin Chen, Sourav (Sid) Dey, Alice Yang, Sam Alexander, Craig D'Cruz, Hern Stephen Randolph Lauren, Brian lo tanto, Pablo y Chariou .

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Producción de VNP
Cámara para plantas de interiorPercival ScientificE-41L2
V. unguiculata semillas (California black-eye n.º 5)Burpee51771A
N. benthamiana semillasLas semillas de N. benthamiana fueron un obsequio del Instituto Salk. Las semillas se producen mediante propagación vegetal.
CarborundoFisherC192-500
Sustrato para macetas Pro-mix BXPremier Horticulture713400
Fertilizante Jack's Professional 20-10-20 Peat-LiteJR Peters77860
Equipamiento
rotor Ti 50.2Beckman337901
Rotor SW 32 TiBeckman369694
Optima L-90K ultracentrífugaBeckman365672
rotor SLA-3000Thermo Scientific07149
rotor SS-34Thermo Scientific28020
centrífuga Sorvall RC-6 PlusThermo Scientific46910
Botella de polipropilenoBeckman355607Para rotor SLA-3000
Botella de policarbonatoBeckman357002Para rotor SS-34
Tubo Ultra-ClaroBeckman344058Para gradiente de sacarosa y rotor SW 32 Ti
Botella de policarbonatoBeckman355618Para la centrifugación y rotor 50.2 Ti
espectrofotómetro NanoDropThermo ScientificNanoDrop2000c
Sistema de geles precolados PowerEase 500InvitrogenEI8675EU
Columna de exclusión por tamaño Superose 6 10/300 GL (24 ml)GE Healthcare17-5172-01
ÄCromatógrafo KTA Explorer 100GE Healthcare28-4062-66
Allegra X-12RBeckman392302Centrífuga de banco
CriostatoLeicaCM1850
Maestro 2Caliper Life Sciencesin vivo sistema de imagenología
Tissue-TearorBiospec Products985370-395
Lector de microplacasTecanInfinite-200
Microscopio electrónico de transmisiónZEISSLibra 200FE
microscopio confocal de barrido láser FluoViewOlympusFV1000
Productos químicos y reactivos
3-etinilanilinaSigma Aldrich498289-5G
placa negra de 384 pocillosBD Biosciences353285
Gel SDS-PAGE NuPAGE Bis-Tris 4-12 %InvitrogenNP0321BOX
Tampón de muestra LDS 4XInvitrogenNP0008
Ácido acéticoFisherA385-500
AcetonitriloSigma Aldrich271004-1L
azida Alexa Fluor 647InvitrogenA10277
Ácido carboxílico Alexa Fluor 647, éster succinimidiloInvitrogenA20006
Filtros centrífugos Amicon Ultra-0.5 mlMilliporeUFC501096corte de 10 kDa
Clorhidrato de aminoguanidinaAcros Organics36891-0250
Ácido bóricoFisherA74-500
Azul Brillante de Coomassie R-250FisherBP101-25
CsClAcros Organics42285-1000
DAPIMP Biomedicals157574
DimetilsulfóxidoFisherBP231-100
Papel de filtroFisher09-801KGrado P5
FITC anti-murino CD31BioLegend102406
Suero de cabraInvitrogen16210-064
KClFisherBP366-500
sal sódica del ácido L-ascórbicoAcros Organics35268-0050
MetanolFisherA412P-4
MgCl2FisherBP214-500
Láminas para microscopioFisher12-544-3
Cubreobjetos para microscopioVWR48366-277
tampón MOPSInvitrogenNP0001
mPEG-malNanocsPG1-ML-2kPM 2000
mPEG-N₃NanocsPG1-AZ-5kPM 5000
mPEG-NHSNanocsPG1-SC-5kPM 5000
NaClFisherBP358-212
Oregon Green 488 éster succinimidilo *isómero 6*InvitrogenO-6149
ácido p-toluenosulfónico monohidratoAcros Organics13902-0050
PermountFisherSP15-100
Fosfato dipotásicoFisherBP363-1
Fosfato monobásico de potasioFisherBP362-1
acetato de sodioFisherBP333-500
Nitrito de sodioAcros Organics42435-0050
Sulfito de sodioAmresco0628-500G
SacarosaFisherS6-500
rejilla para microscopía electrónica de transmisiónTed PellaFCF-400Cu
Tris baseFisherBP152-500
Tritón X-100EMD ChemicalsTX1568-1
β-mercapto–etanolFisherO3446I-100
Cultivo de tejidos
Suero bovino fetalInvitrogen12483-020
HemocitómetroFisher0267110
Células HT-29ATCCHTB-38
L-glutaminaInvitrogen25030-080
PBSCellgro21-040-CV
Penicilina-estreptomicinaInvitrogen10378-016
RPMI-1640Invitrogen31800-089
Frascos para cultivo de tejidosCorning431080175 cm2
Azul de tripanoThermo ScientificSV30084.01
Tripsina, 0,05 % (1X) con EDTA 4Na, líquidoInvitrogen25300-054
Estudios con animales
Dieta para roedores con 18 % de proteínaHarlan TekladTeklad Global 2018SDieta libre de alfalfa
Jeringa para insulinaBD Biosciences32941028 gauge
IsofluranoBaxterAHN3637
Matriz de membrana basal MatrigelBD Biosciences356234
ratones NCR nu/nuEscuela CWRU
de Medicina Instalaciones Centrales de Animales Atímicos y Xenoinjertos
Jeringa estérilBD Biosciences30519618 1/2 gauge
Tissue-Tek CRYO-OCT CompoundAndwin Scientific4583

Referencias

  1. Description of Plant Viruses [Internet]. , Association of Biologists. Warwick, UK. Available from: http://dpvweb.net/ (2012).
  2. Carrillo-Tripp, M., Shepherd, C. M., Borelli, I. A., Venkataraman, S., Lander, G., Natarajan, P., Johnson, J. E., Brooks, C. L., Reddy, V. S. VIPERdb2: an enhanced and web API enabled relational database for structural virology. Nucl. Acids Res. 37, 436-442 (2009).
  3. Pokorski, J. K., Steinmetz, N. F. The art of engineering viral nanoparticles. Mol. Pharm. 8, 29-43 (2011).
  4. Steinmetz, N. F., Lin, T., Lomonossoff, G. P., Johnson, J. E. Structure-based engineering of an icosahedral virus for nanomedicine and nanotechnology. Curr. Top Microbiol. Immunol. 327, 23-58 (2009).
  5. Jung, B., Rao, A. L., Anvari, B. Optical Nano-Constructs Composed of Genome-Depleted Brome Mosaic Virus Doped with a Near Infrared Chromophore for Potential Biomedical Applications. ACS Nano. , (2011).
  6. Leong, H. S., Steinmetz, N. F., Ablack, A., Destito, G., Zijlstra, A., Stuhlmann, H., Manchester, M., Lewis, J. D. Intravital imaging of embryonic and tumor neovasculature using viral nanoparticles. Nat. Protoc. 5, 1406-1417 (2010).
  7. Leopold, P. L., Ferris, B., Grinberg, I., Worgall, S., Hackett, N. R., Crystal, R. G. Fluorescent virions: dynamic tracking of the pathway of adenoviral gene transfer vectors in living cells. Hum. Gene Ther. 9, 367-378 (1998).
  8. Lewis, J. D., Destito, G., Zijlstra, A., Gonzalez, M. J., Quigley, J. P., Manchester, M., Stuhlmann, H. Viral nanoparticles as tools for intravital vascular imaging. Nat. Med. 12, 354-360 (2006).
  9. Steinmetz, N. F., Ablack, A. L., Hickey, J. L., Ablack, J., Manocha, B., Mymryk, J. S., Luyt, L. G., Lewis, J. D. Intravital imaging of human prostate cancer using viral nanoparticles targeted to gastrin-releasing Peptide receptors. Small. 7, 1664-1672 (2011).
  10. Wu, C., Barnhill, H., Liang, X., Wang, Q., Jiang, H. A new probe using hybrid virus-dye nanoparticles for near-infrared fluorescence tomography. Optics Communications. 255, 366-374 (2005).
  11. Steinmetz, N. F., Cho, C. F., Ablack, A., Lewis, J. D., Manchester, M. Cowpea mosaic virus nanoparticles target surface vimentin on cancer cells. Nanomedicine (Lond). 6, 351-364 (2011).
  12. Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y., Hori, K. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release. 65, 271-284 (2000).
  13. Chatterji, A., Ochoa, W., Paine, M., Ratna, B. R., Johnson, J. E., Lin, T. New addresses on an addressable virus nanoblock: uniquely reactive Lys residues on cowpea mosaic virus. Chem. Biol. 11, 855-863 (2004).
  14. Steinmetz, N. F., Mertens, M. E., Taurog, R. E., Johnson, J. E., Commandeur, U., Fischer, R., Manchester, M. Potato virus X as a novel platform for potential biomedical applications. Nano Lett. 10, 305-312 (2010).
  15. Wang, Q., Lin, T., Tang, L., Johnson, J. E., Finn, M. G. Icosahedral virus particles as addressable nanoscale building blocks. Angew. Chem. Int. Ed. 41, 459-462 (2002).
  16. Bruckman, M. A., Kaur, G., Lee, L. A., Xie, F., Sepulveda, J., Breitenkamp, R., Zhang, X., Joralemon, M., Russell, T. P., Emrick, T., Wang, Q. Surface modification of tobacco mosaic virus with "click" chemistry. Chembiochem. 9, 519-523 (2008).
  17. Schlick, T. L., Ding, Z., Kovacs, E. W., Francis, M. B. Dual-surface modification of the tobacco mosaic virus. J. Am. Chem. Soc. 127, 3718-3723 (2005).
  18. Yildiz, I., Tsvetkova, I., Wen, A. M., Shukla, S., Masarapu, M. H., Dragnea, B., Steinmetz, N. F. Engineering of Brome mosaic virus for biomedical applications. RSC Advances. , (2012).
  19. Brunel, F. M., Lewis, J. D., Destito, G., Steinmetz, N. F., Manchester, M., Stuhlmann, H., Dawson, P. E. Hydrazone ligation strategy to assemble multifunctional viral nanoparticles for cell imaging and tumor targeting. Nano Lett. 10, 1093-1097 (2010).
  20. Shukla, S., Ablack, A., Wen, A., Lee, K., Lewis, J., Steinmetz, N. F. Increased tumor homing and tissue penetration of the filamentous plant viral nanoparticle Potato virus X. Molecular Pharmaceutics. , (2012).
  21. Chatterji, A., Ochoa, W., Shamieh, L., Salakian, S. P., Wong, S. M., Clinton, G., Ghosh, P., Lin, T., Johnson, J. E. Chemical conjugation of heterologous proteins on the surface of Cowpea mosaic virus. Bioconjug. Chem. 15, 807-813 (2004).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Virus vegetalespurificación de CPMVmarcaje fluorescentePEGilacióndireccionamiento tumoralmodelo de xenoinjerto en ratónimagen de fluorescenciamicroscopía confocalcromatografía de exclusión molecular
Las nanopartículas virales para
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.