Resonancia magnética funcional (fMRI) con estimulación auditiva en Songbirds

Resumen

En este artículo se muestra un procedimiento optimizado para obtener imágenes de los sustratos neurales de estimulación auditiva en el cerebro de un pájaro usando resonancia magnética funcional (fMRI). Se describe la preparación de los estímulos de sonido, el posicionamiento del sujeto y la adquisición y el análisis posterior de los datos de resonancia magnética funcional.

Resumen

La neurobiología del canto de los pájaros, como un modelo para el habla humana, es una zona marcada de la investigación en neurociencia conductual. Mientras que los enfoques de electrofisiología y moleculares permiten la investigación de cualquiera de los diferentes estímulos en pocas neuronas, o un estímulo en grandes partes del cerebro, el nivel de oxigenación de la sangre dependiente (BOLD), la resonancia magnética funcional (fMRI) permite combinar ambas ventajas, es decir, comparar la activación neural inducida por diferentes estímulos en todo el cerebro a la vez. fMRI en pájaros cantores es difícil debido al pequeño tamaño de sus cerebros y porque sus huesos y especialmente de su cráneo comprenden numerosas cavidades de aire, provocando importantes artefactos de susceptibilidad. Gradiente eco (GE) BOLD fMRI se ha aplicado con éxito a los pájaros cantores ^1-5 (para una revisión, ver ^6). Estos estudios se centraron en las áreas cerebrales auditivas primarias y secundarias, que son regiones libres de artefactos de susceptibilidad. Sin embargo, debido a proccesos de interés pueden producirse más allá de estas regiones, se requiere toda BOLD fMRI del cerebro usando una secuencia de MRI menos susceptibles a estos artefactos. Esto se puede lograr mediante el uso de eco de espín (SE) BOLD fMRI ^7,8. En este artículo se describe cómo utilizar esta técnica en los pinzones cebra (Taeniopygia guttata), que son pequeños pájaros con un peso corporal de 15 a 25 g ampliamente estudiado en neurociencias del comportamiento de los pájaros. El tema principal de los estudios de resonancia magnética funcional en los pájaros cantores es la percepción de la canción y aprendizaje de la canción. La naturaleza auditiva de los estímulos combinados con la débil sensibilidad BOLD de SE (en comparación con GE) basadas en secuencias de resonancia magnética funcional hace que la aplicación de esta técnica muy difícil.

Protocolo

1. Preparación de los estímulos auditivos

1. Primera grabar el sonido-estímulos mientras se está reproduciendo en el interior del ánima del sistema MR 7T. El agujero es de un espacio confinado que puede distorsionar los estímulos auditivos que resultan en la mejora de ciertas frecuencias auditivas. Figura 1 muestra las frecuencias mejorado y suprimido como se muestra por nuestras grabaciones de ruido blanco hecho en la ubicación de la cabeza del ave dentro de la cavidad del imán utilizando un micrófono de fibra óptica (Optimic 1160, Optoacoustics). Para compensar esta mejora artificial, una función de ecualizador se aplica a cada estímulo usando software de WaveLab. Para nuestra configuración en particular, la función se compone de un núcleo gaussiano con los siguientes parámetros: la amplitud máxima:-20dB, centrada en 3750 Hz, anchura: 0,05 octavas (correspondiente a la gama de 2,500-5,000 Hz para nuestro sistema).
2. Los estímulos de canciones se componen de varios motivos de canciones individuales de cada ave intercalados con períodos de silencio. El dración de estos períodos de silencio se ajusta para mantener la cantidad total de sonido y el silencio idénticas para todos los estímulos. Esta construcción conserva la variabilidad intra-individual e inter-individual natural de duración de la canción. La longitud total de cada estímulo es 16 seg. La intensidad de cada canción se normaliza en términos de emparejado raíz cuadrada de la media y filtrado paso alto a 400 Hz antes de ser integrado en el estímulo completa (canción y períodos de silencio). Estas manipulaciones se realizaron utilizando el software Praat.
3. El experimento consiste en un ON / OFF de diseño alternando periodos de estimulación auditiva bloque (en los bloques) con períodos de reposo (apagado bloques) (Figura 2). Cada bloque (ON y OFF) dura 16 segundos, que corresponde al tiempo de adquisición de imágenes 2 (ver más abajo para la adquisición). Cada tipo de estímulo se presenta 25 veces, lo que resulta en la adquisición de 50 imágenes por estímulo y por sujeto. El orden de presentación de las condiciones que debe ser al azar dentro y entresujetos. Esta orden aleatorio de los estímulos puede ser codificado en el software de presentación.

2. Asunto Preparación

2.1 Sujeto y el tamaño del grupo

Aquí presentamos un protocolo adaptado específicamente para el uso de (adulto) pinzones cebra. La elección de la especie depende de la pregunta científica. Sin embargo, otras consideraciones como la robustez de aves a la anestesia también pueden tenerse en cuenta. Zebra pinzones (Taeniopygia guttata) deben ser alojados en aviarios bajo una luz de 12 horas: 12 horas de oscuridad y tener acceso a alimentos y agua ad libitum durante todo el estudio. El número mínimo de personas por experimento es 15. Este número tiene en cuenta la sensibilidad de la fMRI de espín-eco y la variabilidad inter-individual natural de los fenómenos biológicos medidos en el experimento.

2.2 Instalación de la instalación y preparación del animal

(Para la especificaciónde los equipos utilizados, nos referimos a la lista de reactivos y equipos específicos al final de este artículo)

1. Instale la máscara de pico en la cama de un sistema MRI MR 7T y conectarlo al dispositivo de control de gas con tubos de plástico. Abra las botellas de gas de nitrógeno y oxígeno y conectar el dispositivo de control de gas (oxígeno Caudal: 200 cc / min; nitrógeno: 400 cc / min).

Como se mencionó anteriormente, un sistema de RM 7T se utiliza en la configuración presentada. Otros sistemas de MR con diferentes intensidades de campo son también posibles, pero al 7T se alcanza un buen compromiso entre la relación de señal-a-ruido y el grado de artefactos de susceptibilidad (véase la discusión). A intensidades de campo más altas, la relación de señal-a-ruido aumentará junto con el grado de artefactos de susceptibilidad.

2. Encienda el sistema controlado por retroalimentación y el dispositivo de flujo de aire caliente.
3. Anestesiar el pinzón cebra con el 3% de isoflurano en una mezcla de oxígeno y nitrógeno mediante la introducción de su picoen la máscara y mantener la cabeza hacia abajo hasta que el ave está totalmente anestesiado. Esto puede ser verificada mediante tirando suavemente el pie: cuando el ave está completamente sedado el pie no se retraerá por el ave. Además, los ojos de las aves serán parcialmente cerrados.
4. Introducir la sonda de temperatura cloacal para detectar la temperatura del cuerpo y controlar el ritmo de la respiración mediante la colocación de un sensor neumático debajo del vientre pinzón cebra. Cierre la chaqueta para frenar el cuerpo del ave (Figura 3).
5. Mantener la tasa de respiración dentro del rango 40 - 100 respiraciones por minuto y mantener constante la temperatura corporal dentro de un estrecho rango de 40 ± 0,5 ° C. Cuando el rango de la respiración es demasiado baja / alta, ajuste el nivel de la anestesia (% isoflurano) en consecuencia. Cuando el problema persiste, el experimento debe ser detenido y el animal retira de la configuración con el fin de recuperar.
6. Coloque los altavoces dinámicos no magnéticos en ambos lados de la cabeza y con pinzón cebraellos conecte al amplificador. Asegúrese de que los cables de los altavoces son dirigidos lejos de la sonda de temperatura, ya que puede influir en la lectura de la temperatura cuando se acerca demasiado.
7. Coloque la bobina RF de superficie en la parte superior de la cabeza y el pinzón posición del pinzón cebra en el centro del imán (y de forma automática el centro de la bobina de transmisión, que está situado en el centro del imán) cebra.
8. Reducir el nivel de anestesia a 1,5% de isoflurano mezclado con oxígeno y nitrógeno.

3. Adquisición de Datos

1. Adquirir un conjunto de 1 sagital, 1 horizontal y 1 image explorador (GE) de eco de gradiente coronal (tri-piloto de la secuencia) y conjuntos de imágenes multi-corte horizontal, coronal y sagital (pilotaje en _T2 adquisición rápida relajación mejorada ( RARO) secuencia SE) para determinar la posición del cerebro en el imán (Figura 4).
2. Reducir el ruido de los gradientes aumentando sus tiempos de rampa a 1000 ms.
3. Preparar la secuencia de fMRI: RARE secuencia T ₂ ponderada, eficaz TE: 60 ms, TR: 2000 ms, el factor RARE: 8, FOV: 16 mm, tamaño de la matriz: 64 x 32, orientación: sagital, grosor de corte: 0,75 mm, Inter-slice espesor de cámara: 0,05 mm, 15 rebanadas cubren casi todo el cerebro (Figura 4).
4. Seleccione el protocolo auditiva (estímulos auditivos y el calendario de entrega de estímulo) en el software de presentación. Este protocolo consiste en una secuencia de comandos - para la iniciación de estímulos auditivos específicos - que se ejecutan en un escaneo de número específico. En cada repetición de la secuencia de resonancia magnética funcional, el software del escáner enviará un disparador para el software de presentación auditiva que a su vez registra el número de exploración y ejecuta el comando correspondiente.
5. Para asegurarse de que el software de presentación auditiva no se le escapa ningún disparo desde el escáner, el protocolo auditiva se inicia por primera vez. Una vez que el protocolo está completamente cargado, se inicia la secuencia de resonancia magnética funcional.
6. Cada experimento fMRI es precedida por la adquisición de 12 imágenes ficticias para permitir que la señal atribuida al ruido del escáner para llegar a un estado estable antes de comenzar la estimulación auditiva.
7. Después de la adquisición de cero a llenar los datos a 64 x 64.
8. Echa un primer vistazo (preliminar) de los resultados utilizando la herramienta funcional de Paravision (opcional Processing / Imágenes Funcionales). Calcular la respuesta BOLD diferencial entre todos en los bloques y la línea de base (OFF bloques). Este análisis da una primera indicación de la calidad del experimento. Si la activación no se ve en las áreas auditivas primarias en esta etapa, el ave tenía probablemente no escuchar / procesa los estímulos auditivos debido a problemas técnicos con la presentación del estímulo, nivel de anestesia, etc La configuración debe ser verificada y la medición repetida.
9. Ejecutar una secuencia RARE 3D anatómica en T2 en la misma orientación que las resonancias magnéticas anteriores y con TE efectiva: 60 ms, TR: 2000 ms, el factor RARE: 8, FOV: 16 mm, tamaño de la matriz: 256 x 128 x 64.
10. Cero-llenar los datos a 256 x 256 x 256.
11. Tome el pinzón cebra de la cama MRI y dejar que se recupere de la anestesia en una jaula en una luz roja. Normalmente, la recuperación de un pinzón cebra después de la anestesia con isoflurano va relativamente rápido (máximo 5 minutos). Después de sólo unos minutos, los pájaros van a tratar de ponerse de pie y una vez que está totalmente recuperado del ave, que se posan en una rama en vez de sentarse en la parte inferior de la jaula. La duración de la anestesia es de aproximadamente 2 h durante el presente experimento. El tiempo máximo de la anestesia isoflurano aplica a los pinzones cebra en nuestro laboratorio es de 6 horas, después de lo cual las aves también se recuperaron dentro de los 5 min.

4. Proceso de datos

1. Convertir el MR-data en Analizar o en formato Nifti.
2. Debido a SPM ha sido desarrollado para procesar datos de la fMRI adquiridos en los seres humanos, que es para los voxels de alrededor de 2 mm. Numerosos ajustes SPM se adaptan a este tamaño voxel aproximada. Si uno no wANT para cambiar todos estos parámetros, la forma más sencilla de proceder es aumentar artificialmente el tamaño de voxel de datos de la fMRI aves. Ajuste el tamaño de voxel en la cabecera de multiplicar el tamaño de voxel real por 10 usando MRIcro. Cabe señalar, que tal ajuste no influye en los datos en sí misma, sin remuestreo o cualquier otra modificación se aplica a los datos.

Una alternativa a esto es el uso de 'SPMMouse ", que es una caja de herramientas que permite SPM para abrir y analizar archivos de cualquier dimensión voxel. La herramienta permite a los GDS 'cerebros' de vidrio que se crean a partir de cualquier imagen y ajusta automáticamente las escalas de longitud por defecto basados ​​en los encabezados de los archivos de imagen o datos introducidos por el usuario. Por lo tanto, esta caja de herramientas funciona en el sentido contrario de lo que nos proponemos. En lugar de cambiar el tamaño de voxel de las imágenes que se ajustan en SPM, la configuración predeterminada de SPM se cambian el uso de imágenes con diferentes tamaños de voxel.

3. Vuelva a alinear los datos de la fMRI. Co-registro del conjunto de datos anatómicos en 3D para tque series de tiempo fMRI. Normalizar los datos en 3D (y la serie temporal fMRI co-registrado) el pinzón cebra resonancia magnética del cerebro atlas. Aplicar la matriz de transformación para el conjunto de datos fMRI. Todo esto se puede hacer usando Estadística Parametric Mapping (SPM) 8 software.
4. Suavizar los datos con un ancho de 0,5 mm de núcleo gaussiano utilizando SPM8.
5. Llevar a cabo análisis estadísticos basados ​​en voxel utilizando SPM8. Modelo de los datos como un cuadro-car (sin función de respuesta hemodinámica). Estimar los parámetros del modelo con el restringido algoritmo clásico de máxima verosimilitud. Calcule el efecto medio de cada estímulo auditivo en cada materia (análisis de efectos fijos) y luego calcular las estadísticas de los deseados grupo de análisis (análisis de efectos mixtos).
6. Proyectar el mapa estadístico paramétrico en el pinzón cebra atlas (Figura 5) ⁹ en SPM8 para localizar las activaciones funcionales (Figura 6).

Resultados

Nosotros aquí presentamos visualmente una secuencia optimizada de los procedimientos de formación de imágenes exitosa de sustratos neurales de los estímulos auditivos en el cerebro del pinzón cebra. En primer lugar, el procedimiento descrito para la preparación de los estímulos auditivos resultados en los estímulos que se puede incorporar en un ON / OFF paradigma bloque (Figura 2) y que se normalizan para eliminar las posibles diferencias en nivel de presión de sonido que podría evocar una respues...

Discusión

En este reporte se describe un protocolo optimizado para la detallada caracterización in vivo de sustratos neurales de estimulación auditiva en los pinzones cebra anestesiados.

De acuerdo con el protocolo presentado, la mayoría de los estudios de activación cerebral funcionales en animales utilizando fMRI BOLD, anestesiar a los animales durante la adquisición. Animales de capacitación para acostumbrarlos al entorno imán y el ruido del escáner durante los períodos de estudio también ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Anestésico isoflurano	Isoflo	05260-05
Hardware/software PC-Sam	SA-Instruments		http://www.i4sa.com
Sistema de monitorización y sincronización		1025
Sistema calefactor para roedores pequeños compatible con RM			Modelo 1025 compatible
Sonda de temperatura rectal		RTP-102B	7'', 0.044''
Escáner de RM de 7 T	Bruker Biospin	PHS 70/16
Software Paravision		5.1
Inserto de gradiente		BGA9S	400 mT/m, 300A, 500V
Amplificadores de gradiente	Copley Co., USA	C256
Resonadores de transmisión			Diámetro interno: 72 mm, solo transmisión, desacoplado activo
Antena receptora - Cabeza de ratón cuadratura de 20 mm			Solo recepción, desacoplado activo
Software WaveLab	Steinberg
Software Praat	Paul Boersma, Universidad de Ámsterdam		http://www.praat.org
Altavoces dinámicos no magnéticos	Visation, Alemania	HK 150
Microfóno de fibra óptica	Optoacoustics,	Optimic 1160
Amplificador de sonido	Phonic corporation	MM 1002a
Software Presentation	Neurobehavioral Systems Inc.
MRIcro	Chris Rorden		http://www.cabiatl.com/mricro/mricro/
Mapeo Paramétrico Estadístico (SPM)	Centro Welcome Trust para Neuroimagen	8	http://www.fil.ion.ucl.ac.uk/spm/