Un método para aislar vesículas submitochondrial enriquecidas en F1FO complejos ATP sintasa de cerebro de rata se describe. Estas vesículas permiten el estudio de la actividad de ATPasa F1FO complejo y su modulación mediante la técnica de la grabación de patch clamp.
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las mitocondrias están implicadas en muchas funciones celulares importantes, incluyendo el metabolismo, la supervivencia a 1, el desarrollo y la señalización de calcio 2. Dos de las funciones mitocondriales más importantes están relacionados con la producción eficiente de ATP, la energía de la célula, por la fosforilación oxidativa, y la mediación de señales para la muerte celular programada 3.
La enzima principal responsable de la producción de ATP es la sintasa F1FO-ATP, también llamada ATP sintasa 4-5. En los últimos años, el papel de las mitocondrias en la muerte celular apoptótica y necrótica ha recibido una atención considerable. En la muerte celular apoptótica, Bcl-2 proteínas de la familia tales como Bax entran en la membrana mitocondrial externa, oligomerize y permeabilizan la membrana externa, la liberación de factores pro-apoptóticos en el citosol 6. En la muerte celular necrótica clásico, tal como la producida por la isquemia o la excitotoxicidad en neuronas, un largE, aumento mal regulado en calcio matriz contribuye a la apertura de un poro de la membrana interna, el poro de transición de permeabilidad mitocondrial o mPTP. Esto despolariza la membrana interna y causa cambios osmóticos, lo que contribuye a la ruptura de la membrana externa, la liberación de factores pro-apoptóticos, y la disfunción metabólica. Muchas proteínas incluyendo Bcl-xL 7 interactúan con F1FO ATP sintasa, modulando su función. Bcl-xL interactúa directamente con la subunidad beta de la ATP sintasa F1FO, y esta interacción disminuye la conductancia de una fuga dentro de la F1FOATPasecomplex, el aumento de la red de transporte de H + por F1FO durante F1FO actividad ATPasa 8 y aumentando así la eficiencia mitocondrial. Para estudiar la actividad y la modulación de la ATP sintasa, se aislaron a partir de cerebro de roedores vesículas submitocondriales (SMVS) que contienen F1FO ATPasa. Los SMVS conservan la integridad estructural y funcional de la F1FO ATPasa como se muestra en Alavian et al. Aquí se describe un métodoque hemos usado con éxito para el aislamiento de SMVS de cerebro de rata y delinear la técnica de patch clamp para analizar la actividad del canal (la conductancia de iones de fuga) de los SMVS.
Protocolo
1. Cerebro mitocondrial aislamiento (Adaptado de Brown MR et al. 9)
- Sacrificar la rata utilizando métodos aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC).
- Cortar la cabeza del animal por decapitación, cortar la piel y exponer el cráneo.
- Abra el cráneo suavemente cortando con unas tijeras o pinzas gubias. Retire el cerebro.
- Picar finamente el cerebro sin cerebelo en tampón de aislamiento (véase el cuadro 1) y transferirlo a un ml de vidrio / teflón homogeneizadora 5 (ver lista de equipo).
- Homogeneizar el tejido con cuidado 10 veces (sin burbujas), ap....
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Resultados
El primer paso de nuestro protocolo permite el aislamiento de mitocondrias purificadas como se muestra por Western blot en la Figura 1. En la Figura 2 se muestra un ejemplo de una grabación parche vesícula submitocondriales derivado del cerebro. Uso de la configuración de parche de dentro a fuera se demuestra la actividad del canal modulado por la ATP. El control (CTL) de grabación (izquierda) muestra la actividad del canal de múltiples conductancia con un pico de conductancia de 600 pS.......
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Discusión
Los métodos descritos en este documento permiten el aislamiento de las mitocondrias pura al final de la etapa 1 y las vesículas submitocondriales (SMVS) después de la etapa 2 a partir de todo el cerebro y sin distinción de células phenotypes.SMVspurified por este método están esencialmente libres de contaminación por otros orgánulos subcelulares como se muestra en Figura 1 y nuestro trabajo anterior (Alavian KN et al. 8) y conservar su integridad estructural y funcional antes de la c.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Mortero de tejidos Potter-Elvehjem con pistilo de PTFE | Krackeler Scientific, Inc. | 1-7725T-5 | |
| Centrífuga Eppendorf 5424 | Eppendorf | 5424 000.410 | |
| Recipiente para la ruptura celular 4639 | Parr Instrument Company | 4639 | |
| Ficoll | Sigma-Aldrich | F5415 | |
| Tubos centrífugos de policarbonato | Beckman Coulter | P20314 | |
| Rotor SW-50.1 | Beckman Coulter | ||
| Ultracentrífuga L8-70M | Beckman Coulter | ||
| Digitonina | Sigma-Aldrich | D5628 | |
| Lubrol PX (C12E9) | Calbiochem | 205534 | |
| Axopatch 200B | Axon Instruments | ||
| Digidata 1440A | Molecular Device | ||
| pClamp10.0 | Molecular Device | ||
| Manipulador | Sutter Instrument | ||
| Capilar de vidrio borosilicatado | World Precision Instruments | 1308325 | |
| Modelo de micropipeteador Flaming/Brown P-87 | Sutter Instrument |
Referencias
- Cheng, W. C., Berman, S. B., Ivanovska, I., Jonas, E. A., Lee, S. J., Chen, Y., Kaczmarek, L. K., Pineda, F., Hardwick, J. M. Mitochondrial factors with dual roles in death and survival. Oncogene. 25, 4697-4705 (2006).
- Duchen, M. R., et al. Mitochondria and calcium in health and disease. Cell Calci....
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Reimpresiones y permisos
