Artículo de método

Citometría de masas: Protocolo para la afinación y servicio diario muestras de células en un citómetro de masas CyTOF

DOI:

10.3791/4398

⸱

2 de noviembre de 2012

 , 
1Human Immune Monitoring Center, Institute for Immunity, Transplantation, and Infection, Stanford University

En este artículo

Resumen

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Las medidas necesarias para la sintonización diaria y la optimización del rendimiento de un citómetro de masa CyTOF se describen. Comentarios sobre la preparación de la muestra y el caudal óptimo se discuten

Resumen

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En los últimos años, el rápido análisis de células individuales que comúnmente se ha realizado usando citometría de flujo y anticuerpos marcadas con fluorescencia. Sin embargo, la cuestión de la superposición espectral de emisión de fluoróforo ha limitado el número de sondas simultáneamente. En contraste, el nuevo citómetro CyTOF masa por DVS pareja Ciencias un líquido único sistema de células de introducción a una ICP-MS. 1 En lugar de fluoróforos, polímeros quelantes que contienen altamente enriquecido isótopos metálicos están acopladas a anticuerpos u otras sondas específicas. 2-5 Debido a la pureza del metal y resolución de masa del citómetro de masa, no hay "superposición espectral" de isótopos vecinos, y por lo tanto no hay necesidad de matrices de compensación. Además, debido a la utilización de metales lantánidos, no hay fondo biológica y por lo tanto no equivalente de la autofluorescencia. Con una ventana de masa que abarca masa atómica 103-203, teóricamente hasta 100 etiquetas se podía distinguir simultáneamente. Actualmente, Más de 35 canales disponibles utilizando los reactivos quelantes disponible en Ciencias de la DVS, lo que permite una disección sin precedentes del perfil inmunológico de las muestras. 6-7

Las desventajas de la citometría de masa incluyen el requisito estricto de un isótopo de metal separado por sonda (no equivalente de dispersión frontal o lateral), y el hecho de que es una técnica destructiva (sin posibilidad de ordenar la recuperación). La configuración actual del citómetro de masa también tiene una velocidad de transmisión de células de sólo ~ 25%, por lo que requieren un número de entrada más alta de células.

Óptimo rendimiento diario del citómetro de masas requiere varios pasos. El objetivo básico de la optimización es maximizar la intensidad de señal medida de los isótopos metálicos deseados (M) mientras se minimiza la formación de óxidos (M +16) que disminuirá la intensidad de la señal M e interferir con cualquier señal deseada a M +16. El primer paso es para calentar la máquina para un caliente, estable ICP plasma ha sido establecida. En segundo lugar, los ajustes para la velocidad de flujo de gas actual y el maquillaje debe ser optimizado en una base diaria. Durante la recogida de la muestra, la velocidad de células de evento máxima está limitada por la eficiencia del detector y la velocidad de procesamiento a 1000 células / segundo. Sin embargo, dependiendo de la calidad de la muestra, un tipo de célula caso, más lento (300-500 células / segundo) es por lo general deseable para permitir una mejor resolución entre los eventos de las células y por lo tanto maximizar singletes intactas sobre dobletes y escombros. Por último, la adecuada limpieza de la máquina al final del día ayuda a minimizar la señal de fondo debido a metal libre.

Protocolo

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Todas las muestras de células para la CyTOF debe ser fijada y permeabilizada. Esto permite una mayor entrada de la intercalador de ADN que contiene iridio, y también previene la lisis celular durante el lavado con agua MilliQ y resuspensión inmediatamente antes de la inyección en el citómetro de masa.

1. Puesta en marcha del citómetro de masas

  1. Abra el programa CyTOF. Seleccione Configuración del instrumento. En la ficha canastilla para tarjetas, vaya a la esquina inferior derecha y haga clic Calentador botón "ON". Encender el calentador de al menos 15 min antes de tiempo deseado para permitir tiempo suficiente para que el manto....

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Resultados

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Siguiendo el protocolo anterior debe lograr cuatro cosas. En primer lugar, lo que permite suficiente tiempo de calentamiento para el citómetro de masas producirá un plasma caliente, estable necesaria para la formación óptima de la señal y óxido mínima. Segundo lavado adecuado del citómetro de masa con agua MilliQ y la solución de lavado DVS (Figura 9) ayudará a reducir los niveles de adsorción de metal a los tubos y otras partes de la máquina, lo que ayuda a reducir el fondo durante la adquisición de mu.......

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Discusión

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Para las últimas décadas, la citometría de flujo de fluorescencia ha sido un método caballo de trabajo para el análisis de células individuales, tanto en términos de expresión en la superficie y en ensayos funcionales. Sin embargo, los problemas de la superposición espectral de los colorantes fluorescentes se ha limitado el número de marcadores simultáneas. Mientras que los experimentos que utilizan más de 12 marcadores simultáneos se ha informado, el monto de la compensación necesaria que hace que este técnicamente dif.......

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Divulgaciones

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Los autores del trabajo, tanto en el Centro de Monitoreo inmunológico humano, un centro de servicio en la Universidad de Stanford que cobra tarifas a los usuarios únicamente para recuperar el costo de los ensayos, incluyendo citometría de masas.

Agradecimientos

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Nos gustaría dar las gracias al Dr. Evan Newell y el Dr. Sean Bendall para la retroalimentación. También nos gustaría dar las gracias Ciencias DVS y el Dr. Sean Bendall para una muestra de las perlas de poliestireno múltiples que contienen lantánidos. Estamos muy agradecidos por la financiación de los NIH subvención AI057229 U19 2.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo Comentarios
CyTOF TM masa citómetro DVS Ciencias
Solución de lavado DVS Ciencias 201071 0,05% de ácido fluorhídrico en agua
Ajuste solución DVS Ciencias 201072 0,5 ppm La, Cs, Tb, Tm, Ir, ácido nítrico rastro
Eu que contienen perlas de poliestireno DVS Ciencias 201073 Contiene los isótopos naturales de abundancia de la UE; granos suministrados a aproximadamente 1 millón / mL
Múltiples que contienen lantánidos (La / Pr / Tb / Tm / Lu) - perlas de poliestireno DVS Ciencias Todavía no disponible en el mercado Contiene abundancia natural de isótopos de lantánidos cotizadas
Ácido nítrico (concentrado) Fisher Scientific A467-500 Optima rastro de metal puro ICP-MS grado
El poliestireno de fondo redondo de tubo con células colador cap-5mL BD 352235 utiliza para filtrar las muestras de células antes de la inyección
Norma-Ject tuberkulin jeringa 1 ml Henke Sass Lobo 4010-200V0 sin silicona, libre de látex
Norma-Ject-3 ml jeringa Henke Sass Lobo 4010.000V0 sin silicona, libre de látex
MilliQ agua 18 mW agua pura; no debe ser almacenado en botellas de vidrio o plástico que han sido lavadas con detergente comercial (debido a sus altos niveles de bario presente).
Citranox Sigma-Aldrich Z273236 ácido detergente
Gas argón Praxair AR 5.0UH-T 99,999% de pureza ultra alta

Referencias

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  1. Bandura, D. R. Mass cytometry: Technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma Time-of-Flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81, 6813-6822 (2009).
  2. Lou, X. Polymer....

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