Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

Resumen

Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas. K _{M Y K Cat Fueron obtenidos para la hidrólisis del dominio catalítico de SENP1 (SUMO / sentrin proteasa específica 1) para pre-SUMO1 (Small ubiquitina-como modificador). Los principios generales de este estudio cuantitativo proteasa-FRET basada cinética se puede aplicar a otras proteasas.}

Resumen

Reversibles modificaciones postraduccionales de proteínas con proteínas de ubiquitina o ubiquitina como-(Ubls) son ampliamente utilizados para regular dinámicamente actividad de la proteína y tiene diversas funciones en muchos procesos biológicos. Por ejemplo, SUMO modifica covalentemente un gran número o proteínas con papeles importantes en muchos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular y la muerte, la respuesta de daño del ADN, y la respuesta de estrés 1-5. SENP, como SUMO-proteasa específica, funciona como una endopeptidasa en la maduración de los precursores SUMO o como un isopeptidase para eliminar SUMO de sus proteínas diana y refrescar el ciclo SUMOylation ^1,3,6,7.

La eficiencia catalítica o la especificidad de una enzima se caracteriza mejor por la relación de las constantes cinéticas, k _cat / K _M. En varios estudios, los parámetros cinéticos de SUMO-SENP pares han sido determinados por varios métodos, incluyendo en gel de poliacrilamida basado en western-blot, radIOActive sustrato marcado, compuesto fluorescente o proteína sustrato marcado ^8-13. Sin embargo, las técnicas de poliacrilamida-gel a base, que utilizaron los "nativos" de proteínas, pero son laboriosos y técnicamente exigente, que no se prestan a un análisis cuantitativo detallado. La obtenido k _cat / K _M de estudios usando tetrapéptidos o proteínas con un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo eran o bien hasta dos órdenes de magnitud menor que los sustratos naturales o no puede diferenciar claramente las iso-y las actividades de endopeptidasa SENPs.

Ensayos de la proteasa Recientemente, basados ​​en FRET se utilizan para estudiar las enzimas deubiquitinating (DUBs) o SENPs con el par de FRET cian proteína fluorescente (PPC) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) ^9,10,14,15. La relación de emisión de aceptor de emisión del donante se utiliza como el parámetro cuantitativo para FRET monitor de señal de proteasa acdad determinación. Sin embargo, este método ignora la señal contaminaciones cruzadas en el aceptor y longitudes de onda de emisión por donantes aceptor y donante de auto-fluorescencia y por lo tanto no era correcta.

Hemos desarrollado un novedoso altamente sensible y cuantitativo FRET basada en el ensayo de la proteasa para la determinación de los parámetros cinéticos de pre-SUMO1 maduración por SENP1. Un par de ingeniería FRET CyPet y YPet con mejorado significativamente la eficiencia de FRET y rendimiento cuántico de fluorescencia, se usaron para generar el CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sustrato ^16. Hemos diferenciado y cuantificados absolutos señales de fluorescencia aportados por el donante y el aceptor y FRET en las longitudes de onda de emisión de aceptor y, respectivamente. El valor de k _cat / K _M se obtuvo como (3,2 ± 0,55) x 10 ⁷ M ^-1 s ^-1 de SENP1 hacia pre-SUMO1, que está de acuerdo con los parámetros generales de cinéticas enzimáticas. Por lo tanto, esta metodología es válida y se puede utilizar unsa Enfoque general para caracterizar otras proteasas también.

Protocolo

1. Construcciones de plásmidos

1. Amplificar los marcos de lectura abiertos de los genes por PCR, y clonar los productos de PCR en pCRII-TOPO vector.
2. Confirmar los productos mediante secuenciación, y clonar el ADNc que codifica CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y dominios catalíticos de SENP1 en la pET28 (b) vector con una etiqueta de hexahistidina N-terminal.

2. Expresión y purificación de proteínas

1. Transformar células de Escherichia coli de la cepa BL21 (DE3) con pET28 (b) vectores que codifican CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y los dominios catalíticos de SENP1. <....

Discusión

Tecnología FRET ha sido utilizada para estudiar la maduración pre-SUMO1 de por SENP1 ^9. CFP-YFP se utilizó como el par de FRET y el análisis radiométrico, que es la relación de aceptor a las emisiones de los donantes, se utilizó para caracterizar las propiedades cinéticas. Sin embargo, no existe ninguna consideración de donante y aceptor de auto-fluorescencia en la ratiométrica tradicional análisis FRET. La relación no se correlacionan directamente con la cantidad de sustrato digerido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
PCR II TOPO Kit	Invitrogen	K466040
2xYT	Investigación de Productos Internationa.l Corp.	X15600
Ni-NTA agarosa	Thermo Scientific	88222
Más Coomassie (Bradford) Regent Ensayo	Thermo Scientific	23238
384-así placa (con fondo de cristal)	Greiner	781892
FlexStation II 384 lector de placas	Dispositivo Molecular