Cuantitativo FRET (transferencia de energía de resonancia de Förster) Análisis para SENP1 Proteasa Determinación Kinetics

Resumen

Un nuevo método que implica el análisis cuantitativo de FRET (transferencia de energía por resonancia de Förster) señales se describe para el estudio de la cinética de enzimas. K _{M Y K Cat Fueron obtenidos para la hidrólisis del dominio catalítico de SENP1 (SUMO / sentrin proteasa específica 1) para pre-SUMO1 (Small ubiquitina-como modificador). Los principios generales de este estudio cuantitativo proteasa-FRET basada cinética se puede aplicar a otras proteasas.}

Resumen

Reversibles modificaciones postraduccionales de proteínas con proteínas de ubiquitina o ubiquitina como-(Ubls) son ampliamente utilizados para regular dinámicamente actividad de la proteína y tiene diversas funciones en muchos procesos biológicos. Por ejemplo, SUMO modifica covalentemente un gran número o proteínas con papeles importantes en muchos procesos celulares, incluyendo la regulación del ciclo celular, la supervivencia celular y la muerte, la respuesta de daño del ADN, y la respuesta de estrés 1-5. SENP, como SUMO-proteasa específica, funciona como una endopeptidasa en la maduración de los precursores SUMO o como un isopeptidase para eliminar SUMO de sus proteínas diana y refrescar el ciclo SUMOylation ^1,3,6,7.

La eficiencia catalítica o la especificidad de una enzima se caracteriza mejor por la relación de las constantes cinéticas, k _cat / K _M. En varios estudios, los parámetros cinéticos de SUMO-SENP pares han sido determinados por varios métodos, incluyendo en gel de poliacrilamida basado en western-blot, radIOActive sustrato marcado, compuesto fluorescente o proteína sustrato marcado ^8-13. Sin embargo, las técnicas de poliacrilamida-gel a base, que utilizaron los "nativos" de proteínas, pero son laboriosos y técnicamente exigente, que no se prestan a un análisis cuantitativo detallado. La obtenido k _cat / K _M de estudios usando tetrapéptidos o proteínas con un ACC (7-amino-4-carbamoylmetylcoumarin) o AMC (7-amino-4-metilcumarina) fluoróforo eran o bien hasta dos órdenes de magnitud menor que los sustratos naturales o no puede diferenciar claramente las iso-y las actividades de endopeptidasa SENPs.

Ensayos de la proteasa Recientemente, basados ​​en FRET se utilizan para estudiar las enzimas deubiquitinating (DUBs) o SENPs con el par de FRET cian proteína fluorescente (PPC) y la proteína amarilla fluorescente (YFP) ^9,10,14,15. La relación de emisión de aceptor de emisión del donante se utiliza como el parámetro cuantitativo para FRET monitor de señal de proteasa acdad determinación. Sin embargo, este método ignora la señal contaminaciones cruzadas en el aceptor y longitudes de onda de emisión por donantes aceptor y donante de auto-fluorescencia y por lo tanto no era correcta.

Hemos desarrollado un novedoso altamente sensible y cuantitativo FRET basada en el ensayo de la proteasa para la determinación de los parámetros cinéticos de pre-SUMO1 maduración por SENP1. Un par de ingeniería FRET CyPet y YPet con mejorado significativamente la eficiencia de FRET y rendimiento cuántico de fluorescencia, se usaron para generar el CyPet-(pre-SUMO1)-YPet sustrato ^16. Hemos diferenciado y cuantificados absolutos señales de fluorescencia aportados por el donante y el aceptor y FRET en las longitudes de onda de emisión de aceptor y, respectivamente. El valor de k _cat / K _M se obtuvo como (3,2 ± 0,55) x 10 ⁷ M ^-1 s ^-1 de SENP1 hacia pre-SUMO1, que está de acuerdo con los parámetros generales de cinéticas enzimáticas. Por lo tanto, esta metodología es válida y se puede utilizar unsa Enfoque general para caracterizar otras proteasas también.

Protocolo

1. Construcciones de plásmidos

1. Amplificar los marcos de lectura abiertos de los genes por PCR, y clonar los productos de PCR en pCRII-TOPO vector.
2. Confirmar los productos mediante secuenciación, y clonar el ADNc que codifica CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y dominios catalíticos de SENP1 en la pET28 (b) vector con una etiqueta de hexahistidina N-terminal.

2. Expresión y purificación de proteínas

1. Transformar células de Escherichia coli de la cepa BL21 (DE3) con pET28 (b) vectores que codifican CyPet-(pre-SUMO1)-YPet, CyPet SUMO1-, YPet y los dominios catalíticos de SENP1.
2. Crecido las bacterias transformadas en medio 2xYT durante 3 horas a 37 ° C (con agitación a 250 rpm) hasta alcanzar una densidad óptica de 0,5 a 600 nm.
3. Añadir 100 mM isopropil-β-D-tiogalactósido (IPTG) (concentración final) para inducir la expresión de la proteína y agitar durante 16 horas a 25 ° C a 200 rpm.
4. Coseche las bacterias por centrifugación a 10.000 rpm a 4 ° C durante 5 min y se resuspenden en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM, y 5 mM de imidazol.
5. Sonicar las células durante 10 min en 5-sec intervalos a una potencia de 25 W utilizando MiSonics 4.000 sonicador y recogerlas por centrifugación a 35.000 xg a 4 ° C durante 30 min.
6. Configurar la columna con 500 ml de Ni-NTA perlas para el cultivo de L 1 y transferir el sobrenadante a la columna.
7. La resina se lava con tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, y 10 mM imidazol dos veces.
8. Proteína se eluye con tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 500 mM, y 500 mM de imidazol y la diálisis en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), NaCl 50 mM y 1 mM de ditiotreitol (DTT) a 4 ° C durante la noche.
9. Determinar las concentraciones de las proteínas purificadas mediante el ensayo de Bradford. Método alternativo para las mediciones de concentración de proteínas será SDS-PAGE electroforesis en gel y después se tiñeron con azul de Coomassie seguido con imágenescuantitativo.

3. Cuantitativo FRET análisis de espectro

1. La estrategia general para el ensayo FRET se basa en la señalización (Figura 1). El par de FRET, CyPet y YPet, fue etiquetada para la N-y C-terminales, respectivamente, de pre-SUMO1. SENP1 escinde la proteína de fusión CyPet-(pre-SUMO1)-YPet en el lugar de Gly-Gly en SUMO1 del C-terminal y, por lo tanto, libera la cola con SUMO YPet. La señal de FRET se interrumpe, lo que resulta en un aumento de la emisión de CyPet y una dramática disminución de la emisión de YPet en la longitud de onda de excitación CyPet.
2. Cuando es excitado por la luz de longitud de onda de 414 nm, la emisión total de fluorescencia de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet a 530 nm se puede derivar de tres fuentes: la emisión del absoluto FRET inducida YPet, el CyPet directa de emisiones y YPet directa de emisiones (Figura 2).

donde FL _{530/414 <}/ Sub> es el total de las emisiones de fluorescencia a 530 nm cuando se excita a 414 nm, FL _FRET es el absoluto señal de FRET, FL _{CyPet (cont)} es la emisión CyPet directa cuando se excita a 414 nm, y FL _{YPet (cont)} es la YPet directas de las emisiones cuando se excita a 414 nm. El subíndice de (cont) representa la contribución.

3. La emisión directa de CyPet a 530 nm era proporcional a su emisión a 475 nm cuando se excita a 414 nm con una relación constante de α. CyPet-SUMO1 se preparó a concentraciones de 50, 100, 200, 500, y 750 nM y 1 mM y las emisiones a 475 y 530 nm se midió después de excitación a 414 nm para determinar α (Figura 3-1).
4. La emisión directa de YPet a 530 nm con excitación a 414 nm era proporcional a su emisión a 530 nm cuando se excita a 475 nm con una relación constante de β. YPet se preparó a concentraciones de 50, 100, 200, 500, 750 and 1.000 nm, y la emisión a 530 nm se midió cuando las muestras fueron excitados por longitudes de onda de 414 y 475 nm para determinar β (Figura 3-2).
5. Cuando CyPet-(pre-SUMO1)-YPet fue digerido por SENP1, la escisión libera CyPet-SUMO1 y la cola SUMO1 con YPet. Cuando el compuesto se excita a 414 nm, la emisión de fluorescencia a 530 nm (FL _'530/414) se redujo, pero aún se pueden dividir en tres partes como:

donde FL _'530/414 es la emisión total de fluorescencia a 530 nm después de la digestión cuando se excita a 414 nm, FL' _FRET es el restante absoluto señal de FRET, _CyPet FL _'(475/414) es la emisión CyPet a 475 nm después de la digestión cuando excita a 414 nm (en este caso la emisión CyPet es de dos partes: sin digerir CyPet-(pre-SUMO1)-YPet y digerido CyPet-SUMO1), y _YPet FL(530/475) es la emisión YPet cuando se excita a 475 nm, que es constante si CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se digiere o no.

6. Después de la digestión por SENP1, el restante FRET emisión _(FL-FRET) es:

donde C es la concentración total de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet y x es la concentración de digerido CyPet-(pre-SUMO1)-YPet.

7. Mediante la combinación de todos los elementos, la emisión de fluorescencia detectada a 530 nm bajo excitación de 414 nm ₍₅₃₀ FL _{'/ 414)} es:

4. FRET basada en el Ensayo de la Proteasa Estudio de cinética enzimática

1. CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se incubó con el dominio catalítico de SENP1 a 37 ° C en un tampón de 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 50 mM NaCl, 0,1% (v /v) de Tween-20 y 1 mM de DTT a un volumen total de 80 ml y se transfirió a 384-así placa.
2. Carreras se llevaron a cabo mediante la medición de la emisión de fluorescencia a 475 y 530 nm después de una excitación a 414 nm en un lector de placas de fluorescencia de múltiples pocillos durante 5 min con 15-sec intervalos.
3. La velocidad de reacción (v) se correlacionó con el cambio en la cantidad de sustrato (S) como:

4. La concentración de producto aumentado exponencialmente desde 0 como [S] ₀ (concentración de sustrato original) cuando t = 0:

5. Cuando t = 0, la velocidad inicial (V ₀₎ es:

6. La concentration de SENP1 se fijó, y la concentración de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet se aumentó de 100 veces más que la concentración de la enzima, que es requerido por la ecuación de Michaelis-Menten.
7. Todas las lecturas fluorescentes fueron analizadas por el método de análisis cuantitativo FRET y se representan en GraphPad Prism Software V para adaptarse a la ecuación de Michaelis-Menten. La regresión no lineal también se puede realizar con la ayuda de paquetes de software más comunes, como los programas de hojas de cálculo (por ejemplo, Microsoft Excel).

5. Los resultados representativos

La maduración de pre-SUMO1 por SENP1 puede determinarse controlando los cambios en la señal de fluorescencia a 475 y 530 nm durante el proceso. El resultado mostró que la velocidad de la pre-SUMO1 digestión por SENP1 en una manera dependiente de la dosis-sustrato (Figura 4). Esto sugiere que el dominio catalítico de SENP1 exhibe una excelente actividad para la maduración de los pre-SUMO1. La reacción inicialvelocidades ción se calcularon por el análisis anterior con diferentes concentraciones de sustrato (Tabla 1).

El k _cat / K _M se utiliza generalmente para comparar las eficiencias de los diferentes enzimas con un sustrato o una enzima en particular con diferentes sustratos. K _M y V _max se puede obtener de la ecuación de Michaelis-Menten por el trazado de las diversas velocidades iniciales, correspondientes a las diferentes concentraciones de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet (Figura 5) k _gato se obtuvo en forma.:

De acuerdo con el análisis anterior, se calculó un K _M fue de 0,21 ± 0,04 mM, el _gato k fue 6,90 ± 0,28 s ^-1, y la k _cat / K _M proporción fue de (3,2 ± 0,55) x 10 ⁷ M ^-1 > S ^-1.

Figura 1. Gráfico de ensayo de la proteasa FRET basado en un pre-sumos SENP de maduración.

Figura 2. Análisis cuantitativo de la señal fluorescente como contribuciones por el donante, aceptor y FRET. La disección de los espectros de emisión de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet bajo excitación a 414 nm. _CyPet FL _(530/414) Se emisión CyPet de a 530 nm bajo excitación de 414 nm, FL _FRET es la emisión FRET inducida YPet a 530 nm bajo excitación de 414 nm, y FL _{YPet (530/414)} es la emisión YPet de a 530 nm bajo excitación de 414 nm.

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Figura 3. Cálculo del factor de α y β dirección de emisión.

Figura 4. Análisis cuantitativo de CyPet-(pre-SUMO1)-YPet digerido por diferentes proporciones de al dominio catalítico de SENP1. Las reacciones se controlaron dentro de los primeros 5 min.

Figura 5. Michaelis-Menten análisis gráfico de digestión CyPet-(pre-SUMO1)-YPet de por SENP1. Los datos se representaron gráficamente y se analizaron por GraphPad Prism V y regresión no lineal.

[S] (mM)	V 0 (mM / s)
0,115	0,0023 ± 0,00005
0,214	0,0028 ± 0,00004
0,407	0,0033 ± 0,00007
0,594	0,0037 ± 0,00013
0,725	0,0043 ± 0,00012
1,471	0,0051 ± 0,00036
1,899	0,0050 ± 0,00031
2,300	0,0050 ± 0,00062

Tabla 1. Determinación de las velocidades iniciales de la maduración de los pre-SUMO1 por SENP1. En cada concentración de sustrato, cuatro muestras se utilizaron para medir la digestión. La desviación estándar de vino de las variaciones de estas cuatro muestras.

K M (M)	k cat (s-1)	k cat / K M (M -1 s •-1)
0,21 ± 0,04	6,90 ± 0,28	3,2 ± 0,55 × 10 7

Tabla 2. Parámetros cinéticos de la maduración del pre-SUMO1 por SENP1 cuantitativos de análisis FRET. La desviación estándar de vino de las cuatro muestras en cada concentración de sustrato.

Discusión

Tecnología FRET ha sido utilizada para estudiar la maduración pre-SUMO1 de por SENP1 ^9. CFP-YFP se utilizó como el par de FRET y el análisis radiométrico, que es la relación de aceptor a las emisiones de los donantes, se utilizó para caracterizar las propiedades cinéticas. Sin embargo, no existe ninguna consideración de donante y aceptor de auto-fluorescencia en la ratiométrica tradicional análisis FRET. La relación no se correlacionan directamente con la cantidad de sustrato digerido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
PCR II TOPO Kit	Invitrogen	K466040
2xYT	Investigación de Productos Internationa.l Corp.	X15600
Ni-NTA agarosa	Thermo Scientific	88222
Más Coomassie (Bradford) Regent Ensayo	Thermo Scientific	23238
384-así placa (con fondo de cristal)	Greiner	781892
FlexStation II 384 lector de placas	Dispositivo Molecular