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Artículo de método

Microgavage de larvas de pez cebra

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DOI:

10.3791/4434

⸱

20 de febrero de 2013

 , 
1Department of Cell and Molecular Physiology, University of North Carolina at Chapel Hill

En este artículo

Resumen

Presentamos un método novedoso para la microsondaje de peces cebra larvales que utiliza equipos estándar de microinyección de embriones y estereomicroscopía. Demostramos que el microsondaje es una técnica segura y eficiente, útil para administrar cantidades controladas de diversos materiales directamente en la luz intestinal de larvas de pez cebra.

Resumen

El pez cebra ha surgido como un organismo modelo poderoso para estudiar el desarrollo intestinal1-5, la fisiología6-11, las enfermedades12-16 y las interacciones huésped-microbio17-25. Los enfoques experimentales para estudiar la biología intestinal a menudo requieren la introducción in vivo de materiales seleccionados en la luz del intestino. En el modelo de pez cebra larvario, esto se logra típicamente sumergiendo los peces en una solución del material seleccionado o mediante inyección a través de la pared abdominal. Con el método de inmersión, es difícil monitorear o controlar con precisión la ruta o el momento de la administración del material al intestino. Por esta razón, la exposición por inmersión puede causar toxicidad no intencionada y otros efectos sobre tejidos extraintestinales, limitando el rango potencial de cantidades de material que pueden administrarse en el intestino. Además, la cantidad de material ingerido durante la exposición por inmersión puede variar significativamente entre larvas individuales26. Aunque estos problemas no se presentan durante la inyección directa a través de la pared abdominal, realizar una inyección adecuada es difícil y causa daño tisular que podría influir en los resultados experimentales. Presentamos un método de microsondaje en larvas de pez cebra. El objetivo de este método es proporcionar una forma segura, eficaz y consistente de administrar material directamente a la luz del intestino anterior en larvas de pez cebra con un control preciso del momento. El microsondaje utiliza equipos estándar de microinyección de embriones y microscopía estereoscópica comunes en la mayoría de los laboratorios que realizan investigaciones con pez cebra. Una vez que los peces están correctamente posicionados en metilcelulosa, el sondaje puede realizarse rápidamente a un ritmo de aproximadamente 7-10 peces/min, y la supervivencia tras el sondaje se acerca al 100%, dependiendo del material administrado. También mostramos que el microsondaje permite cargar la luz intestinal con altas concentraciones de materiales que son letales para los peces cuando se exponen por inmersión. Para demostrar la utilidad de este método, presentamos un ensayo de microsondaje con dextrano fluorescente que puede utilizarse para cuantificar el tránsito desde la luz intestinal hacia espacios extraintestinales. Esta prueba puede emplearse para verificar la correcta ejecución del procedimiento de microsondaje y también proporciona un ensayo novedoso en pez cebra para examinar la integridad de la barrera epitelial intestinal bajo diferentes condiciones experimentales (p. ej., manipulación genética, tratamiento con fármacos o exposición a factores ambientales). Además, mostramos cómo el sondaje puede utilizarse para evaluar la motilidad intestinal mediante la administración de microesferas fluorescentes y el seguimiento de su tránsito posterior. El microsondaje puede aplicarse para administrar diversos materiales, como microorganismos vivos, factores microbianos secretados/toxinas, agentes farmacológicos y sondas fisiológicas. Con estas capacidades, el método de microsondaje en larvas de pez cebra tiene el potencial de potenciar una amplia gama de campos de investigación que utilizan el sistema modelo de pez cebra.

Protocolo

Utilizamos protocolos publicados para el manejo y mantenimiento estándar de pez cebra con el fin de obtener larvas para microgavaje27. Principalmente utilizamos reproducción natural para la propagación de los peces, los cuales se mantienen bajo un ciclo de 14 horas de luz y 10 horas de oscuridad. Este protocolo ha sido optimizado para el microgavaje de larvas de pez cebra a los 6-7 días post-fecundación (dpf). Se espera que estos métodos sean aplicables en general a etapas de desarrollo más jóvenes y más avanzadas con modificaciones menores. A menos que se indique lo contrario, utilizamos la cepa silvestre TL de pez cebra a los 6 dpf, y los peces no fueron alimentados. Todos los experimentos se realizaron en agua del sistema obtenida de nuestra instalación convencional de acuicultura de pez cebra; sin embargo, se puede utilizar cualquier medio adecuado para pez cebra (por ejemplo, medio para embriones o medio gnotobiótico para pez cebra (GZM)28). En este protocolo, nos referimos a «medio para pez cebra» para representar el medio elegido por el usuario.

1. Preparación de metilcelulosa, molde para sonda de gavaje y fabricación de aguja para microgavaje

El día anterior o temprano el día del experimento, prepare la metilcelulosa, el molde de agarosa para la estabilización de las larvas y las agujas para microadministración oral.

  1. Disuelva 3 g de metilcelulosa en 100 ml de agua estéril desionizada o medio para pez cebra (según la aplicación) para obtener una solución al 3%. Añada una barra magnética al frasco, caliente el agua hasta casi hervir y colóquelo en una placa agitadora a alta temperatura. Mientras agita, espolvoree lentamente la metilcelulosa para asegurarse de que no se aglomere. Reduzca lentamente la velocidad de agitación y la temperatura de la placa a lo largo del día hasta alcanzar la temperatura ambiente.
  2. Continúe agitando suavemente durante la noche hasta que la metilcelulosa se haya disuelto completamente. La solución se puede almacenar a temperatura ambiente durante varios meses en un recipiente hermético.
  3. Prepare un molde de gel de agarosa al 3% en una placa de Petri de 10 cm utilizando un molde de plástico (Adaptive Science Tools, TU-1) según las instrucciones del fabricante. Selle con parafilm y almacene a 4 °C hasta su uso para evitar la desecación. Caliente a temperatura ambiente o 28 °C antes del experimento. Los moldes de agarosa generalmente se pueden reutilizar varias veces.
  4. Prepare varias agujas para gavaje utilizando capilares de vidrio de borosilicato y un micropipeteador Flaming Brown equipado con un filamento calefactor de ranura ancha (FT330B). Los programas que utilizamos para la fabricación de las agujas son los siguientes:
Tipo de agujaPresiónCalorTracciónVelocidadTiempo
embrionario50031510050200
por gavaje50031512575200

Dado que los filamentos pueden variar entre instrumentos, registre el tiempo de rampa (tiempo de calentamiento activo). Nuestro tiempo de rampa oscila entre 8,57 y 8,79 ms para este programa. Este programa crea agujas más cortas y robustas que las agujas tradicionales para microinyección (Figura 1). Es posible que estos parámetros deban optimizarse para su uso en diferentes micropipeteadoras.

2. Recorte, carga y calibración de las agujas de microsonda gástrica

Nota*: El corte de la aguja es un paso crítico en este protocolo. Además, los métodos para cargar y calibrar la aguja variarán según el tipo de unidad de microinyección utilizada. Hemos optimizado este protocolo utilizando microinyectores Drummond II, pero anticipamos que este protocolo también será aplicable a otros instrumentos de microinyección con modificaciones menores. Dado que los equipos de inyección y los tiradores de agujas variarán entre laboratorios, será importante medir/calibrar los volúmenes de inyección (ver sección 2.8).

  1. Las agujas se recortan bajo un estereomicroscopio. Utilizamos un estereomicroscopio Leica S6E ajustado a un aumento de 2,5x. En esta configuración, nuestra retícula ocular con 100 divisiones tiene una longitud de 2 mm.
  2. Alinee la punta de la aguja con el extremo de la regla de la retícula (marca de división 100) y corte la aguja usando pinzas de relojero de punta fina a aproximadamente 1 mm de la punta (marca de división 48-50) (Figura 1A).
  3. La aguja debe tener un diámetro de aproximadamente 27-30 μm y ser roma. Examine las puntas de las agujas a un aumento de 100x. Las agujas afiladas o irregulares tienen mayor probabilidad de causar daño durante la gavaje y deben evitarse en lo posible.
  4. Alternativamente, cuando esté disponible, se puede utilizar un microfusor para controlar mejor el punto de corte de la aguja y pulir sus puntas mediante calor para eliminar bordes afilados (Figura 1B).
  5. Prepare la solución de gavaje. Para la mayoría de las aplicaciones, preparamos la solución añadiendo una dilución 1:10 de una solución al 0,5 % de rojo de fenol en solución salina tamponada con fosfatos de Dulbecco (DPBS) (Sigma-Aldrich) para asegurar que la solución sea visible bajo el estereomicroscopio, permitiendo monitorear el funcionamiento adecuado del microinyector y la colocación de la solución de gavaje en la ampolla anterior. No se han evaluado colorantes distintos al rojo de fenol, pero podrían utilizarse.
  6. Prepare la aguja de gavaje llenándola con aceite mineral usando una jeringa de 1 ml con una aguja de 25G 5/8. Monte la aguja en la unidad de microinyección Nanoject II.
  7. Envuelva un plato de Petri de plástico de 10 cm con parafilm para proporcionar una superficie plana e impermeable y coloque alícuotas de aproximadamente 2 μl de la solución de gavaje sobre el parafilm. Llene manualmente la aguja de gavaje, teniendo cuidado de evitar la formación de burbujas de aire en el aceite mineral.
  8. Para probar el funcionamiento del microinyector y calibrar el volumen de eyección, llene un plato de Petri de 3 cm con aceite mineral e inyecte en el aceite hasta que las gotas tengan un tamaño constante. Mida el diámetro de las gotas utilizando la retícula o una función de medición del estereomicroscopio, si está disponible. Calcule el volumen de la gota (Ecuación: V=4/3πr3). Se representa gráficamente la consistencia del volumen entre agujas (Figura 1C).
  9. Lave la punta de la aguja mediante inmersiones repetidas en medio limpio para pez cebra para eliminar el aceite mineral residual antes de iniciar la gavaje. El aceite mineral es muy denso y podría causar daño a los tejidos epiteliales si no se elimina de la punta de la aguja.

3. Anestesia, montaje y administración por sonda gástrica de larvas de pez cebra

  1. Caliente el molde de agarosa a temperatura ambiente o a 28 °C antes del experimento.
  2. Prepare el molde de agarosa para la gavaje cubriendo 3 surcos con metilcelulosa al 3%. Utilice una cantidad de metilcelulosa suficiente para cubrir los surcos y sostener los peces, pero no tan escasa que se seque rápidamente.
  3. En una placa de 6 pocillos limpia, distribuya larvas de pez cebra para cada grupo experimental en pocillos separados, cada uno conteniendo 3,5-4,0 ml de medio para pez cebra.
  4. Prepare una solución de tricaina 3x (0,05% p/v) en el medio adecuado para pez cebra. Anestesie los peces uno por uno agregando un volumen igual de tricaina 3x al pocillo que contiene las larvas, para obtener una concentración final de 1,5x (0,025%), y agite suavemente.
  5. En cuanto los peces cebra dejen de moverse, retírelos del pocillo usando una pipeta Pasteur de vidrio con orificio ancho y una bomba para pipeta, y colóquelos uno a uno sobre la metilcelulosa con la cabeza en el ángulo de 45° del surco y la cola orientada hacia el ángulo de 90° del surco. Presione suavemente sobre ellos con una sonda de disección romo para estabilizar su posición.
  6. Ajuste el equipo de microinyección Nanoject II de modo que la aguja esté inclinada en un ángulo poco pronunciado, aproximadamente paralelo al ángulo de 45° del molde de agarosa. Asegúrese de que el rango de extensión de la aguja sea suficiente para alcanzar más allá del fondo del pocillo del molde, de forma que se requieran menos ajustes una vez colocados los peces.
  7. Configure la unidad de microinyección para liberar 4,6 nl (máximo) en el modo de inyección lenta (23 nl/seg). Con estos ajustes, el volumen inyectado debe llenar apenas la ampolla intestinal anterior sin salir por el esófago ni por la cloaca. Pueden usarse volúmenes menores dependiendo del objetivo del experimento.
  8. Use una mano para realizar ajustes menores en la placa que contiene las larvas inmovilizadas mientras simultáneamente controla con la otra el manipulador de la unidad de microinyección.
  9. Maniobre suavemente la aguja de gavaje dentro de la boca del pez anestesiado, a través del esófago, y presione ligeramente el esfínter esofágico para introducir la punta de la aguja justo dentro de la ampolla intestinal anterior (Figura 2, paso 1-2, a&b).
  10. Una vez dentro de la ampolla anterior, presione suavemente el pedal o botón de inyección para administrar el material. Retire la aguja con rapidez y suavidad, intentando no liberar cantidades significativas de material en el esófago (Figura 2, paso 3-4).
  11. Después de la gavaje, use una pipeta Pasteur de vidrio con orificio ancho y una bomba para pipeta para mover suavemente las larvas de pez cebra a medio fresco. Llene la pipeta con agua hasta unos 2,5 cm por encima del codo de la pipeta, cree un pequeño bolsillo de agua en la metilcelulosa junto a la cabeza de la larva para liberarla, levante suavemente la cabeza hacia la boca de la pipeta y extraiga la larva de la metilcelulosa. Expulse suavemente el pez y toda el agua de la pipeta en un recipiente con medio fresco.
  12. Lave las larvas en medio fresco aspirando y expulsando suavemente con la pipeta o salpicando con medio varias veces para eliminar la metilcelulosa y reanimar a las larvas de la anestesia. Transfiera las larvas a una placa de Petri o a una placa de 6 pocillos hasta que sean necesarias para análisis e imágenes posteriores.

4. Ensayo de dextrano para evaluar la seguridad de la administración por sonda y la integridad de la barrera intestinal

La microgavaje puede utilizarse para administrar diversos materiales al intestino. Como ejemplo, a continuación se proporciona un protocolo para la administración por gavaje de un dextrano de 10 kD conjugado con Texas Red, con el fin de analizar la integridad de la barrera del epitelio intestinal. Existen al menos dos rutas potenciales de permeabilidad paracelular, que difieren en su selectividad según la carga y el tamaño de los solutos, denominadas vías de «poro» o de «fuga»29. Dado que este dextrano es demasiado grande para ser absorbido a través del epitelio intestinal mediante la vía paracelular de poro (límite de tamaño ~4Å, dextrano de 10 kD = ~23Å)9,30-32, debería permanecer dentro de la luz intestinal si la integridad de la barrera no está comprometida. Aunque el dextrano de 10 kD podría transportarse a través de la vía paracelular de fuga, esta vía tiene menor capacidad y cinética más lenta29,33, por lo que es poco probable que ocurra dentro del período de tiempo de este ensayo. Un tratamiento de «control positivo» para alterar la integridad de la barrera se logra mediante la inclusión de EDTA, que interrumpe las uniones estrechas del epitelio34,35. Este ensayo de gavaje con dextrano puede utilizarse como una prueba de control de calidad para demostrar que el procedimiento de gavaje se realiza de forma segura y sin daño tisular no intencionado. Además, este ensayo puede emplearse para evaluar la integridad de la barrera intestinal en función del genotipo o del tratamiento.

  1. Preparar las siguientes soluciones para gavaje: dextrana al 1 % / PBS 1x / rojo de fenol al 0,05 % y dextrana al 1 % / EDTA 20 mM / PBS 1x / rojo de fenol al 0,05 % (control positivo). El stock de dextrana al 5 % en ddH2O se almacena en alícuotas de 50 μl a -20 °C para reducir el número de ciclos de congelación-descongelación. Asimismo, preparar una solución de gavaje simulada de PBS 1x / rojo de fenol al 0,05 %.
    control + (EDTA)sin EDTA
 stockfinalfactor de dilución10 μl10 μl
EDTA, pH 8200 mM20 mM1010
Dextrana5%1%522
PBS10x1x1011
Rojo de fenol0.50%0.05%1011
   subtotal:54
   ddH2O:56
   Total:1010
  1. Utilice el protocolo de la sección 3 para administrar por sonda gástrica a grupos de 10-20 larvas de pez cebra para cada condición experimental. Repita este procedimiento con grupos duplicados o triplicados si es posible.
  2. Después de la administración por sonda, recupere las larvas de la anestesia y permita que naden libremente en medio fresco.
  3. A los 18-20 minutos posteriores a la administración por sonda, vuelva a anestesiar las larvas como en el paso 3.3. Coloque las larvas en metilcelulosa al 3 % sobre un bloque de agarosa al 3 % (esto reduce el brillo de fondo durante la obtención de imágenes).
  4. Obtenga imágenes de las larvas con un estereoscopio de fluorescencia (por ejemplo, Leica M205C) y un conjunto de filtros Texas Red, a un aumento que muestre las larvas desde el hocico hasta inmediatamente posterior al extremo de la cloaca.
  5. Adquiera todas las imágenes con los mismos ajustes de exposición para que puedan cuantificarse y compararse posteriormente. La fluorescencia será intensa en la luz intestinal de todas las larvas inyectadas con dextrano, pero la función de barrera se evalúa por el nivel de dextrano que aparece en los tejidos extraintestinales (es decir, el tronco y los vasos sanguíneos) (Figura 5). Ajuste la exposición a valores que permitan la visualización de la fluorescencia del tronco, incluso si esto sobreexpone la fluorescencia de la luz.
  6. Espacie los momentos de administración por sonda de manera que cada grupo pase aproximadamente el mismo tiempo en recuperación después de la administración y se obtengan imágenes en el mismo momento aproximado posterior a la administración. Para este experimento, cada grupo tarda aproximadamente 1 hora en completarse con una sola persona. Los peces se anestesian a los 18-20 minutos posteriores a la administración, y la obtención de imágenes toma aproximadamente 1-2 minutos por pez.
  7. Utilice un programa de análisis de imágenes como ImageJ para cuantificar la intensidad media relativa de fluorescencia en una región del tronco justo por encima del intestino. Normalice estos valores restando una medición de fondo tomada en una región de la imagen fuera del pez.
  8. Represente gráficamente y analice los datos del análisis de imágenes utilizando GraphPad Prism o un software estadístico similar.

5. Ensayo con microesferas fluorescentes para evaluar la motilidad intestinal

La administración por gavaje proporciona un mayor control sobre el momento y la cantidad de material que se entrega al intestino, lo que la convierte en un método alternativo ideal para estudios de motilidad intestinal. Las técnicas publicadas previamente para medir la motilidad intestinal en larvas de pez cebra incluyen la observación directa de contracciones y ondas intestinales mediante microscopía1,21,36, o la alimentación de larvas con alimento mezclado con microesferas fluorescentes de poliestireno de color verde-amarillo26. En algunos estudios, la cuantificación de los patrones de motilidad intestinal se ha mejorado sumergiendo las larvas en un medio que contiene colorante alimentario37 o mediante una técnica especializada de análisis de video denominada mapeo espacio-temporal38,39. Aquí presentamos un estudio de prueba de concepto para demostrar que es posible administrar por gavaje microesferas fluorescentes en la ampolla anterior intestinal, y que el seguimiento del movimiento de las microesferas puede utilizarse para evaluar la motilidad intestinal (Figura 6). La diferencia principal entre este método y el enfoque de Field y colaboradores26 es que las perlas se introducen por separado y no pueden incorporarse al alimento debido a las limitaciones del diámetro de la aguja de gavaje.

  1. Mantenga larvas de pez cebra en placas de 10 cm con 35 ml de medio hasta que se realice el experimento a los 7 dpf. Comience a alimentar las larvas una vez al día por la mañana a partir de los 5 dpf con aproximadamente 0,6 mg de alimento en polvo (dieta para larvas, como se describió previamente40; administrado usando un asa de inoculación estéril de 1 mm).
  2. Agite suavemente el frasco de microesferas de poliestireno Fluoresbrite YG de 2,0 μm (~2,5% de suspensión acuosa) para mezclar la suspensión. Aliquote una gota del frasco sobre parafilm para poder medir un volumen específico mediante pipeteo.
  3. En un tubo eppendorf, centrifugue las perlas a baja velocidad en una microcentrífuga de banco, retire el sobrenadante y reemplácelo con PBS 1x hasta el volumen original. Repita este proceso para lavar las microesferas dos veces.
  4. Prepare una suspensión para gavaje que contenga 0,25% de microesferas (dilución 1:10 de la suspensión stock)/PBS 1x/0,05% de rojo de fenol. Hay aproximadamente 2,6x103 microesferas en el volumen de gavaje de 4,6 nl administrado por larva.
  5. Utilice el protocolo de la sección 3 para realizar el gavaje al número deseado de larvas. Las microesferas son algo flotantes; por lo tanto, el gavaje debe realizarse lo más rápidamente posible para maximizar la consistencia de la suspensión.
  6. En este experimento, se realizó gavaje a 15 larvas, que luego se mantuvieron en pozos individuales de una placa de 12 pocillos tras su recuperación de la anestesia, con el fin de seguir el tránsito en individuos. Sin embargo, también se pueden gavajar grupos más grandes y evaluar el tránsito a nivel poblacional en lugar de individual. Consulte Field et al. para las prácticas estándar26.
  7. Evalue la motilidad intestinal calificando la ubicación más rostral (o anterior) de las microesferas fluorescentes en larvas vivas en diferentes momentos, utilizando un estereomicroscopio de fluorescencia. Anestesie brevemente las larvas en tricaina 1x (0,017%) y califique las zonas de localización de las microesferas o capture imágenes para calificar posteriormente.
  8. Represente gráficamente y compare el porcentaje de larvas totales con microesferas en una región intestinal determinada a lo largo del tiempo.

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Resultados

Cuando la gavaje se realiza correctamente, el material administrado debe quedar completamente contenido dentro del intestino anterior, con poco o ningún residuo en el esófago (Figura 3). Se debe elegir un volumen de administración que pueda alojarse dentro de la ampolla anterior y que no se filtre a través de la cloaca o del esófago. Si el volumen del material o la presión de administración es demasiado elevado, la fuerza física de la gavaje podría provocar daños o fugas a través del epitelio. También po...

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Discusión

En este trabajo, describimos un protocolo novedoso para la administración directa de materiales al intestino de larvas de pez cebra mediante microsondaje. Existen varios pasos críticos a lo largo del procedimiento que deben tenerse en cuenta. Primero, las larvas de pez cebra deben encontrarse en buen estado de salud antes del experimento de sondaje para prevenir la muerte no relacionada con el tratamiento. Otro factor importante es la calidad de la aguja de sondaje. Una de las partes más difíciles del protocolo consiste ...

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Divulgaciones

No se declararon conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos a los miembros del laboratorio de Rawls por sus valiosas sugerencias sobre el contenido y al Dr. Alan Fanning por las discusiones útiles sobre la permeabilidad según el tamaño de las uniones estrechas y los métodos de interrupción. También agradecemos al Dr. Michael Chua y al Dr. Neal Kramarcy de la Instalación de Microscopía Michael Hooker por el apoyo con el microscopio confocal. Este trabajo fue apoyado por subsidios de los National Institutes of Health T32 DK007737-15 (becario J.L.C.), F32 DK094592 (para J.L.C.) y R01 DK081426 (para J.F.R.).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Finquel (metanosulfonato de tricaina)Argent Chemical LaboratoriesMS-222Anestesia de larvas
Solución de rojo de fenolSigma-AldrichP0290-100 mlAl 0,5 % en DPBS, probado para cultivo celular
Aceite mineral, ligero, blanco (alta pureza)AmrescoJ217-500 mlPara rellenado posterior de agujas y pruebas de volumen
Dextrano TxRed, peso molecular 10.000, fijable con lisinaInvitrogen/ Molecular ProbesD-1863Suspensión al 1 % en PBS 1x/rojo de fenol
FM4-64FXInvitrogen/ Molecular ProbesF34653Solución stock 5 mM en agua
MetilcelulosaMP Biochemicals0215549590
Capilares de vidrio borosilicatadoDrummond Scientific3-000-203-G/XDiámetro externo 1,14 mm, diámetro interno 0,53 mm, longitud 3,5 pulgadas
Forma plástica para fabricación de moldesAdaptive Science ToolsTU-1
Unidad de microinyección Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
Extractor de micropipetas Flaming Brown, filamento ancho de 3,0 mmSutter Instrument Co.P-97, FT330BFabricación de agujas
Pinzas Dumont #5 para estudiantesFine Science Tools91150-200,1 x 0,06 mm, corte de agujas
Retículo ocular, 5 mm - 100 divisionesLeica10394771Corte de agujas
MicroforjaNarishigeMF-900Corte de agujas y pulido con llama
Aguja para jeringa Tuberculin SlipTipBecton Dickinson3096261 ml, aguja 25G 5/8
Microesferas Fluoresbrite YG (2,0 μm)Polysciences, Inc.18338Análisis de motilidad intestinal
Microscopio estereoscópico de disecciónLeicaS6EProcedimiento de gavaje
Microscopio estereoscópico de fluorescenciaLeicaM205CEnsayo de barrera con dextrano
Microscopio confocalZeissLSM510Imagen del dextrano en circulación

Referencias

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