Captura selectiva de 5-hidroximetilcitosina a partir de ADN genómico

Resumen

Se describe un proceso de etiquetado en dos etapas utilizando β-glucosiltransferasa (β-GT) para transferir una azida-glucosa al 5-HMC, seguido de química para transferir un enlazador de biotina para el enriquecimiento fácil y densidad independiente. Este método de marcaje eficaz y específico permite el enriquecimiento de 5-HMC con fondo extremadamente bajo y de alto rendimiento de mapeo epigenómico a través de secuenciación de próxima generación.

Resumen

5-metilcitosina (5-mC) constituye ~ 2-8% de las citosinas en el total de ADN genómico humano y afecta a una amplia gama de funciones biológicas, incluyendo la expresión génica, el mantenimiento de la integridad del genoma, impronta parental, inactivación del cromosoma X, la regulación de desarrollo, el envejecimiento y el cáncer ^1. Recientemente, la presencia de un oxidó 5-MC, 5-hidroximetilcitosina (HMC-5), fue descubierto en células de mamífero, en particular en madre embrionarias (ES) de células y células neuronales ^2-4. 5-HMC es generada por la oxidación de 5-mC catalizada por TET familia del hierro (II) / α-cetoglutarato dependiente de dioxigenasas ^{2, 3.} 5-HMC es propuesto para que participen en el mantenimiento de la madre embrionarias (ES) de células, la hematopoyesis normal y tumores malignos, y cigoto desarrollo ^{2, 5-10.} Para comprender mejor la función de 5-HMC, un sistema de secuenciación fiable y sencilla es esencial. Secuenciación de bisulfito tradicionales no pueden distinguir 5 HMC de 5-MC ¹¹ 12.

Aquí se describe un sencillo procedimiento en dos etapas para el etiquetado de productos químicos selectivos de 5-HMC. En la primera etapa de etiquetado, 5-HMC en el ADN genómico se marca con un catalizada 6-azida-glucosa por β-GT, una glucosiltransferasa a partir del bacteriófago T4, de una manera que transfiere el 6-azida-glucosa al 5-HMC de la modificado cofactor, UDP-6-N3-Glc (6-N3UDPG). En la segunda etapa de biotinilación,, un enlazador disulfuro de biotina se une al grupo azida por la química clic. Ambas etapas son altamente específicos y eficiente, llevando a completar el etiquetado independientemente de la abundancia de la 5-HMC en regiones genómicas y dando fondo extremadamente bajo. Después de biotinilación de 5-HMC, los fragmentos de ADN de 5 HMC que contienen son entonces selectivamente capturadoutilizando perlas de estreptavidina de una manera independiente de la densidad. El resultante 5-HMC enriquecidos con fragmentos de ADN se podría utilizar para los análisis posteriores, incluyendo secuenciación de próxima generación.

Nuestra etiquetado selectivo y protocolo de captura confiere una alta sensibilidad, aplicable a cualquier fuente de ADN genómico con variables / diversa 5-HMC abundancias. Aunque el propósito principal de este protocolo es su aplicación aguas abajo (es decir., Secuenciación de próxima generación para mapear la distribución de 5-HMC en el genoma), es compatible con una sola molécula, en tiempo real SMRT (ADN) secuenciación, que es capaz de ofrecer una sola base de secuenciación resolución de 5-HMC.

Protocolo

1. Fragmentación de ADN genómico

El fragmento de ADN genómico utilizando sonicación a un intervalo de tamaño deseado adecuado para la plataforma de secuenciación de todo el genoma. (Por lo general, sonicar a ~ 300 pb.) Verificar la distribución del tamaño del ADN genómico fragmentado en 1% de gel de agarosa (Figura 1).

2. Preparación de ADN

Determinar las cantidades de ADN de partida basado en la abundancia de la 5-HMC en el ADN genómico. Dado que los niveles de 5-HMC varían significativamente en diferentes tipos de tejidos, a partir cantidades de ADN dependen de los n....

Discusión

5-hidroximetilcitosina (HMC-5) es un presente identificado recientemente modificación epigenética en cantidades sustanciales en ciertos tipos de células de mamíferos. El método presentado aquí es para determinar la distribución en todo el genoma de la 5-HMC. Usamos bacteriófago T4 β-glucosiltransferasa para transferir un resto de glucosa de ingeniería que contiene un grupo azida en el grupo hidroxilo de la 5-HMC. El grupo azida se pueden modificar químicamente con biotina para la detección, enriquecimiento de afinidad, .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre	Empresa	Catálogo	Comentario
			Reactivos
El cloruro de sodio 5 M (NaCl)	Promega	V4221
0,5 M pH 8,0 ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)	Promega	V4231
Trizma base 1 M (Tris), pH 7,5	Invitrogen	15567-027)
HEPES 1 M, pH 7,4	Invitrogen	15630
Cloruro de magnesio (MgCl 2) 1M	Ambion	AM9530g
Sulfóxido de dimetilo (DMSO)	Sigma	D8418
Tween 20	Fisher BioReagents	BP337-100
DBCO-SS-biotina-conjugado PEG3	Haga clic en Herramientas Química	A112P3
1,4-ditiotreitol, ultrapura (TDT) superpuro	Invitrogen	15508-013
QIAquick Kit de eliminación de nucleótidos	Qiagen	28304
Micro Bio-Spin 6 Columna	Bio-Rad	732-6222
Dynabeads MyOne	Invitrogen	650-01
Estreptavidina C1
Qiagen MinElute PCR Purification Kit	Qiagen	28004
UltraPure agarosa	Invitrogen	16500500
UDP-6-N 3-glucosa	Active Motif	55013
			Enzima
β-glucosiltransferasa (β-GT)	New England Biolab	M0357
			Equipo
La sonicación dispositivo	Covaris
Escritorio centrífuga
Baño de agua	Fisher Scientific
Gel corriendo aparato	Bio-Rad
NanoDrop1000	Thermo Scientific
Labquake Tube Shaker	Barnstead
Labquake Tube Shaker	Thermolyne
Soporte Separación Magnética	Promega	Z5342
Qubit 2,0 Fluorómetro	Invitrogen
			Reactivo de configuración 10 X β-GT de tampón de reacción (500 mM de HEPES pH 7,9, 250 mM de MgCl 2) 2 X Encuadernación y lavado (B & W) tampón (10 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 2 M de NaCl, 0,02% Tween 20) .