La aplicación local de medicamentos para estudiar la función del receptor nicotínico de acetilcolina en rodajas de cerebro de ratón

Resumen

En este artículo, se describe un método útil para estudiar ligandos función del canal iónico en las neuronas de rodajas de cerebro agudamente aisladas. Este método implica el uso de una micropipeta de relleno de fármaco para aplicación local de medicamentos a las neuronas registradas utilizando técnicas estándar de patch clamp.

Resumen

El consumo de tabaco provoca numerosos problemas de salud, incluyendo cáncer, enfermedades del corazón, enfisema y derrame cerebral. La adicción a fumar cigarrillos es un trastorno neuropsiquiátrico frecuente que se deriva de las acciones biofísicos y celulares de la nicotina sobre los receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChR) en todo el sistema nervioso central. La comprensión de los diversos subtipos de nAChR que existen en las áreas cerebrales relacionadas con la adicción a la nicotina es una de las principales prioridades.

Los experimentos que emplean técnicas tales como electrofisiología de pinzamiento zonal de célula completa o de dos electrodos grabaciones de tensión de la abrazadera son útiles para la caracterización farmacológica de nAChR de interés. NAChRs expresan las células, tales como células de cultivo de tejidos de mamífero u oocitos de Xenopus laevis, están físicamente aisladas y por lo tanto fácil de estudiar usando las herramientas de la farmacología moderna. Mucho se ha hecho uso de estas técnicas, en particular cuando el receptor diana ya se conocía unnd expresión ectópica se logró fácilmente. A menudo, sin embargo, es necesario estudiar nAChRs en su ambiente nativo: en neuronas dentro de las secciones de cerebro agudamente recogidas de ratones o ratas de laboratorio. Por ejemplo, ratones que expresan "hipersensibles" subunidades de nAChR tales como ratones α4 L9'A ¹ y ratones α6 L9 ^2, permiten la identificación inequívoca de las neuronas en base a su expresión funcional de una subunidad de nAChR específico. Aunque conjunto de células grabaciones patch clamp de neuronas en rodajas de cerebro se realiza rutinariamente por el electrofisiólogo experto, es difícil de aplicar localmente fármacos tales como la acetilcolina o la nicotina a la célula grabada dentro de un corte de cerebro. La dilución de la droga en el superfusato (baño de aplicación) no es rápidamente reversible, y tubo en U sistemas no se adaptan fácilmente para trabajar con secciones de cerebro.

En este trabajo se describe un método para la rápida aplicación de activación de nAChR medicamentos a las neuronas registradas en adultos mOuse rodajas de cerebro. Estándar conjunto de células grabaciones están hechos de neuronas en rodajas, y una micropipeta segunda llena de un fármaco de interés es maniobrado en posición cerca de la célula registrada. Una inyección de aire a presión o nitrógeno inerte en la pipeta relleno de fármaco provoca una pequeña cantidad de solución de fármaco para ser expulsado de la pipeta sobre la celda de grabado. Usando este método, nAChR mediada por las corrientes son capaces de resolver con precisión de milisegundos. Tiempos de solicitud de medicamentos puede variarse fácilmente, y la pipeta de relleno de fármaco puede ser retraído y se reemplaza con una nueva pipeta, permitiendo curvas concentración-respuesta a crear para una sola neurona. Aunque se ha descrito en el contexto de nAChR neurobiología, esta técnica debe ser útil para el estudio de muchos tipos de canales iónicos activados por ligando o los receptores en las neuronas de rodajas de cerebro.

Protocolo

1. Preparación de las soluciones para la preparación de cortes de cerebro y electrofisiología

1. Soluciones para la preparación de secciones de cerebro se han descrito anteriormente ^{3, 4.} Preparar N-metil-D-glucamina (NMDG)-basado de corte y solución de recuperación de la siguiente composición (en mM): 93 N-metil-D-glucamina, 2,5 KCl, 1,2 NaH ₂ PO _4, 30 NaHCO _3, 20 HEPES, 25 glucosa, 5 ascorbato de Na ^+, 2 tiourea, 3 Na ⁺ piruvato, 10 MgSO ₄ • 7H ₂ O, 0,5 CaCl ₂ • 2H ₂ O. Ajuste a 300-310 mOsm con NMDG. Ajustar el pH a 7.3-7.4 con 10 N HCl.

Resultados

En nuestros experimentos, de manera rutinaria grabar de dopamina (DA)-producción de neuronas del área tegmental ventral (VTA) y la sustancia negra pars compacta (SNc). En el modo de fijación de voltaje, presión de aplicación de la acetilcolina o la nicotina a estas células normalmente se traducirá en una corriente rápida, catión hacia dentro que alcanza pico dentro de 100-200 ms (Figura 1A-B). Decaimiento de la corriente es dictada en gran medida por la difusión del fármaco desde el sitio de acción, y s.......

Discusión

El método presentado en este documento es en general útil para el estudio de ligando función del canal iónico en preparaciones de cortes de cerebro. Sin embargo, hay un número de factores que afecten significativamente a la calidad y reproducibilidad de los datos experimentales que resultan de la utilización de este método. Por ejemplo, las corrientes evocadas son muy sensibles al diámetro de la punta de la pipeta de relleno de fármaco. Pequeñas sugerencias causará dificultades con expulsar la solución de fármaco, y con.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo Empresa Número de catálogo
N-metil-D-glucamina	Sigma	M2004
KCl	Sigma	P3911
NaH 2 PO 4	Sigma	S9638
NaHCO 3	Sigma	S6014
HEPES	Sigma	H3375
Glucosa	Sigma	G5767
Na + Ascorbato	Sigma	A4034
Tiourea	Sigma	T8656
Na + Piruvato	Sigma	P2256
MgSO 4 • 7H 2 O	Sigma	230391
De CaCl 2 • 2H 2 0	Sigma	223506
NaCl	Sigma	S9625
Na + Pentobarbital	Vortech Farmacia	76351315
Gluconato de potasio	Sigma	G4500
EGTA	Sigma	E3889
Mg-ATP	Sigma	A9187
GTP	Sigma	G8877
DSK-Zero 1 vibrante slicer	Ted Pella, Inc.
P-97 Flaming / Brown micropipeta extractor	Sutter
Cámara RC-27 Grabación	Warner
TC-344B perfusión controlador calentador	Warner	640101
SH-27B Solución calentador	Warner	640102
Nikon FN-1	Nikon
C-7500 CCD cámara de vídeo	Hamamatsu
Picospritzer III	General Valve Co.
MP-285 Micromanipulador	Sutter
PA-100 traductor piezoeléctrico	Piezosystem jena, Inc.
12V40 piezo amplificador	Piezosystem jena, Inc.
Axopatch 200B	Molecular Devices Corp.
Digidata 1440A	Molecular Devices Corp.