Super-resolución de imagen de la maquinaria de división bacteriana

Resumen

Se describe un super-resolución método de imagen para sondear la organización estructural de la bacteriana FtsZ-anillo, un aparato esencial para la división celular. Este método se basa en análisis cuantitativos de fotoactivados microscopía de localización (palma) y las imágenes se puede aplicar a otras proteínas del citoesqueleto bacterianas.

Resumen

La división celular bacteriana requiere el montaje coordinada de más de diez proteínas esenciales en midcell ^1,2. Fundamental en este proceso es la formación de una supraestructura de tipo anillo (anillo Z) por la proteína FtsZ en el plan de división de ^3,4. El anillo Z se compone de varios monocatenarios protofilamentos FtsZ, y la comprensión de la disposición de los protofilamentos dentro del anillo Z proporcionará información sobre el mecanismo de anillo Z ensamblaje y su función como un generador de fuerza ^5,6. Esta información ha permanecido esquiva debido a las limitaciones actuales en la microscopía de fluorescencia convencional y microscopía electrónica. Microscopía de fluorescencia convencional es incapaz de proporcionar una imagen de alta resolución de la Z-ring debido al límite de difracción de la luz (~ 200 nm). Electrónica cryotomographic imágenes ha detectado disperso en pequeñas protofilamentos FtsZ C. células crescentus ^7, pero es difícil de aplicar a células más grandes, tales comoE. coli o B. subtilis. Aquí se describe la aplicación de un método de microscopía de super-resolución de fluorescencia, microscopía de localización fotoactivado (palma), para caracterizar cuantitativamente la organización estructural de la E. coli Z-anillo ^8.

PALM imagen ofrece una alta resolución espacial (~ 35 nm) y el etiquetado específico para permitir la identificación inequívoca de proteínas diana. Hemos marcado FtsZ con la mEos2 proteína fluorescente fotoactivable, que cambia de verde de fluorescencia (excitación = 488 nm) al rojo de fluorescencia (excitación = 561 nm) tras la activación a 405 nm ^9. Durante un experimento PALM, solo FtsZ-mEos2 moléculas se activan y estocásticamente las posiciones correspondientes centroides de las moléculas individuales se determinan con precisión <20 nm. Una imagen de super-resolución de la Z-ring se reconstruye mediante la superposición de las posiciones del centroide de todos los detectados FtsZ-mEos2 moléculas. <clase p = "jove_content"> Usando este método, se encontró que el anillo Z tiene un ancho fijo de ~ 100 nm y se compone de un paquete suelto de protofilamentos FtsZ que se solapan entre sí en tres dimensiones. Estos datos proporcionan una plataforma para futuras investigaciones de los cambios del ciclo celular dependientes de la ¹⁰ Z-anillo y se puede aplicar a otras proteínas de interés.

Protocolo

1. Preparación de la muestra

1. Inocular medio LB con una sola colonia de la cepa JB281 [BW25113 / pJB042 (P _Lac: FtsZ-mEos2)]. Crecer durante la noche en un agitador a 37 ° C.
2. Se diluye la cultura 1:1,000 a M9 ⁺ mínimos medios de comunicación [sales M9, el 0,4% de glucosa, 2 mM MgSO _4, 0,1 mM CaCl _2, ácidos aminoácidos y vitaminas MEM] y crecer hasta la fase logarítmica media (OD ₆₀₀ = 0,2 a 0,3) en presencia de cloranfenicol (150 ug / ml) a temperatura ambiente (RT).
3. Inducir el cultivo con 20 mM IPTG durante 2 horas (véase Nota # 1).
4. Pellet cultura en microcentrífuga (8.000....

Resultados

Ilustrado en la Figura 3Aiv es una de dos dimensiones, super-resolución de procesamiento de la Z-ring generado a partir del método de obtención de imágenes PALM descrito anteriormente. A continuación, se resume la información cualitativa y cuantitativa que se puede obtener a partir de ellos.

Cualitativamente, se observó que el anillo Z es una estructura irregular que adopta varias configuraciones (banda única o arco helicoidal) que no son distinguibles en las imágenes conven.......

Discusión

PALM imágenes contienen información acerca de los recuentos y las posiciones de moléculas dentro de una célula, permitiendo un análisis detallado de la distribución y la disposición de las moléculas de proteína diana que es difícil de lograr por otros medios. A continuación detallamos las precauciones que se deben tomar para extraer información cuantitativa precisa, manteniendo la relevancia biológica de las imágenes de palma. También explorar la información que puede obtenerse mejor utilizando células vivas vs fijo. Po.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
50 x MEM aminoácidos	Sigma	M5550
100 x vitaminas MEM	Sigma	M6895
IPTG	Mediatech	46 a 102-RF
16% de paraformaldehído	Electrónica Ciencias Micrsocopy	15710-S
SeaPlaque GTG agarosa	Lonzo	50111
50 Cuentas Gold nm	Microesferas-Nanoesferas	790113-010
FCS2 imagen Cámara	Bioptechs
Etapa Adaptador	ASI	I-3017
Microscopio Invertido	Olimpo	IX71
1,45 NA, 60x Objetivo	Olimpo
IXON EMCCD Cámara	Andor Tecnología	DU897E
488-nm láser de zafiro	Coherente
561-nm láser de Zafiro	Coherente
405-nm láser CUBE	Coherente