C. elegans Ensayo de quimiotaxis

Resumen

Un método para evaluar cuantitativamente la respuesta quimiotáctica de los Caenorhabditis elegans Se describe. Un índice quimiotáctico (CI) se empleó como una forma de evaluar con precisión la respuesta de los gusanos a ciertos objetivos, y servir como una plataforma de la comparación entre las cepas y los compuestos de interés.

Resumen

Muchos organismos utilizan la quimiotaxis a buscar las fuentes de alimentos, evitar sustancias nocivas, y encontrar pareja. Caenorhabditis elegans tiene impresionante comportamiento quimiotaxis.

La premisa detrás de probar la respuesta de los gusanos a un odorante es colocarlos en un área y observar el movimiento evocada en respuesta a un odorante. A pesar de los muchos ensayos disponibles, optimizando gusano de partida ubicación con respecto a tanto las zonas de ensayo y de control, y reducir al mínimo la interacción de los gusanos uno con el otro, mientras se mantiene un tamaño de la muestra significativa sigue siendo un trabajo en progreso ^1-10. El método descrito aquí tiene como objetivo hacer frente a estos problemas mediante la modificación del ensayo desarrollado por Bargmann et al. ^1. Una placa de Petri se divide en cuatro cuadrantes, dos cuadrantes opuestos marcados "Prueba" y dos se designan como "control". Anestésico se coloca en todos los sitios de control de prueba y. Los gusanos se colocan en el centro de la placa con un circle marcado alrededor del origen para asegurarse de que se ignoran los gusanos no móviles. La utilización de un sistema de cuatro cuadrantes en lugar de uno o dos 2 1 elimina el sesgo en el movimiento de los gusanos, ya que son equidistantes a partir de muestras de prueba y de control, independientemente de qué lado del origen que comenzaron. Esto evita el problema de los gusanos que se ven obligados a viajar a través de un conjunto de otros gusanos de responder a un olor, lo que puede retrasar gusanos u obligar a tomar una ruta más tortuosa, dando una interpretación incorrecta de su ruta prevista. Este método también presenta ventajas prácticas por tener un tamaño de muestra más grande y permite al investigador para ejecutar el ensayo sin supervisión y marcó los gusanos una vez que el tiempo asignado ha expirado.

Introducción

Ward, desarrollado por primera vez el ensayo de quimiotaxis en 1973 ^5, y desde entonces ha tenido aplicaciones de gran alcance. Neurobiología es un campo que se ha beneficiado del uso de una variedad de ensayos de quimiotaxis. Adaptación olfativa, una forma simple de aprendizaje y la memoria, se ha demostrado en C. elegans utilizando ensayos de quimiotaxis ^6. Ellos también se han utilizado para mostrar que C. elegans pueden desarrollar tolerancia a etanol-un resultado que no sólo demuestra la plasticidad de comportamiento de los gusanos, pero que también muestra que los gusanos pueden ser muy útiles en el estudio de la dependen....

Protocolo

1. Preparación / lavado de los gusanos

1. Sincronizar los gusanos adultos jóvenes ^11.
2. Pipetear 2 ml de la basal S sobre una placa de 5 cm quimiotaxis de escena gusanos que han borrado sólo el césped del OP50 E. coli. Incline la placa según sea necesario para asegurar que los gusanos se lavan de la superficie de la placa en el búfer.
3. Pipetear 1 ml de la solución basal gusano-S en un tubo de microcentrífuga.
4. Centrifugar durante 10 segundos utilizando un PicoFuge a 6.600 rpm.
5. Aspirar el Basal S, dejando el sedimento de gusanos inalteradas.
6. Añadir 1 ml de solución S Basal al tubo de microcentrí....

Resultados

Comparación de tipo salvaje (N2) C. elegans para el ODR-10 (KY10) mutante.

Se utilizó diacetilo, un conocido C. elegans quimioatrayente, para comparar los gusanos de tipo salvaje a la de un mutante que carece del receptor para diacetil ^1,12. Para los gusanos de tipo salvaje (N2), el índice de quimiotaxis fue 0,100 ± 0,066 a etanol y 0,839 ± 0,031 hasta 0,5% diacetil. Como era de esperar, diacetilo provoca una respuesta quimioatrayentes significativ.......

Discusión

La quimiotaxis, aunque controlada por un complejo conjunto de mecanismos neuronales y celulares, puede ser fácil y objetivamente cuantificado utilizando ensayos de quimiotaxis. Para obtener los mejores resultados de los ensayos, se deben tomar ciertos pasos críticos. En primer lugar, la celebración de los gusanos es esencial en la obtención de resultados experimentales consistentes. Gusanos en diferentes etapas de la vida se comportan de manera diferente ^13; gusanos etapa tan mixtas pueden sesgar los resultad.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
S Basal (- colesterol) [5.8 g NaCl; 1 M K fosfato de potasio, pH 6.0; dH2O hasta 1 litro.] Autoclave
PicoFuge	Stratagene	400552
Microscopios	Leica
Disección	Leica
Pipa P1000	Gilson
Pipa P10	Gilson
0.5 M de azida sódica
Agar de Quimiotaxia [1.6% de agar BBL (Benton-Dickinson) o 2% de agar Difco. Autoclave. Añadir 5 mM de fosfato de potasio, pH 6.0; 1 mM de CaCl2, 1 mM de MgSO4]
Etanol/Agua Destilada
Compuestos de prueba (ej. 0.5% de diacetil)
Agar	Bio-Rad	166-0600
NH4Cl	Amresco	CA97062-046
MOPS	VWR	CA12001-120
NH4OH	BDH	CABDH8641-2
0.25% Tween 20	Bio-Rad	170-6531