Prueba Microtracción ambientalmente controlado mecánicamente de adaptación nanocompuestos poliméricos para Ex vivo Caracterización

Summary

Se discute un método por el cual la In vivo Comportamiento mecánico de los materiales sensibles a estímulos se controla como una función de tiempo. Las muestras se prueban Ex vivo El uso de un probador de microtracción con controles ambientales para simular el entorno fisiológico. Este trabajo promueve una mayor comprensión de la In vivo Comportamiento de nuestro material.

Abstract

Micro dispositivos implantables están ganando mucha atención por varias aplicaciones biomédicas ^1-4. Estos dispositivos se han realizado a partir de una variedad de materiales, cada uno con sus propias ventajas y desventajas ^5,6. Lo más prominente, debido a las dimensiones del dispositivo a microescala, se requiere un alto módulo para facilitar la implantación en tejido vivo. Por el contrario, la rigidez del dispositivo debe coincidir con el tejido circundante para minimizar la tensión local, inducida por ^7-9. Por lo tanto, hemos desarrollado recientemente una nueva clase de materiales bio-inspirados para cumplir con estos requisitos, respondiendo a los estímulos ambientales con un cambio en las propiedades mecánicas ^10-14. Específicamente, nuestra nanocompuesto de poli (acetato de vinilo) basado en (PVAc-NC) muestra una reducción en la rigidez cuando se expone al agua y temperaturas elevadas (por ejemplo, la temperatura corporal). Desafortunadamente, existen pocos métodos para cuantificar la rigidez de los materiales in vivo ^15, y mechpruebas mecánicos fuera del entorno fisiológico a menudo requiere grandes muestras no apropiado para la implantación. Además, los materiales que responden a estímulos pueden recuperar rápidamente su rigidez inicial después de la explantación. Por lo tanto, hemos desarrollado un método por el cual las propiedades mecánicas de micromuestras implantados se pueden medir ex vivo, con las condiciones fisiológicas simuladas mantienen utilizando la humedad y el control de la temperatura ^13,16,17.

Para este fin, un comprobador de microtensión costumbre fue diseñado para dar cabida a muestras microescala con ^13,17 ampliamente variables en módulos de Young (rango de 10 MPa a 5 GPa). Como nuestros intereses son en la aplicación de PVAc-NC como una sonda de sustrato neuronal biológicamente-adaptable, una herramienta capaz de caracterización mecánica de las muestras en la microescala era necesario. Esta herramienta se adapta para proporcionar control de humedad y temperatura, que reduce al mínimo de la muestra de secado y enfriamiento ^17. Como resultado, el mecánicoal características de la muestra explantado reflejan estrechamente las de la muestra justo antes de la explantación.

El objetivo general de este método es evaluar cuantitativamente las propiedades mecánicas in vivo, en concreto el módulo de Young, de materia estímulos-respuesta, mecánica adaptable a base de polímeros en. Esto se logra mediante el establecimiento de primero las condiciones ambientales que reduzcan al mínimo un cambio en las propiedades mecánicas de muestras después de la explantación sin contribuir a una reducción en la rigidez independiente de la que resulta de la implantación. Las muestras se prepararon a continuación para la implantación, la manipulación, y las pruebas (Figura 1A). Cada muestra se implanta en la corteza cerebral de ratas, que está representado aquí como un cerebro de rata explantado, durante un tiempo especificado (Figura 1B). En este punto, la muestra se explantados y se carga inmediatamente en el probador microtracción, y después se sometió a ensayos de tracción (figura1C). El análisis posterior de los datos nos permite conocer el comportamiento mecánico de estos materiales innovadores en el ámbito de la corteza cerebral.

Protocol

1. Preparación de la muestra

1. Preparar película PVAc-NC de espesor en el intervalo de 25-100 micras utilizando una solución de colada y de la técnica de compresión ^10-12.
2. Se adhieren a la película de una oblea de silicio por calentamiento en una placa caliente durante dos minutos a 70 ° C (por encima de la temperatura de transición vítrea) para promover el contacto íntimo entre la película y la oblea. Este paso asegura que la película preparada permanece plana y fija a la oblea de Si, que es necesaria para los procesos de micromecanizado planas.
3. Modelo de la película en la muestra de ensayo geometrías por láser micromecanizado (VLS 3.50, VersaLASER). Ajuste los ₂ parámetros de micromecanizado láser escritura directa de CO a 1,0% de potencia (0,5 W), velocidad de 4,0% (56 mm / s), y 1.000 pulsos por pulgada ^13,16.
4. Muestras patrón que se utilizarán para establecer las condiciones ambientales ("muestras de configuración") en estructuras en forma de hueso de perro con las dimensiones almohadilla lateral 1.5 x 1.5 mm ^2, y la viga lateral tenueensiones 300 x 3,000 m ^2, que se combina con un espesor que el de la película a lo largo de (Figura 2).
5. Modelo de las muestras para los experimentos ex vivo ("muestra de implante") en vigas de 300 micras x 6 mm, con un espesor equivalente a la de la película.
6. Liberar cuidadosamente las muestras de la oblea usando una cuchilla de afeitar y pinzas.
7. Para la manipulación de la muestra, preparar a los propietarios de acrílico de encargo-mecanizadas diseñados para servir como parte del sistema de agarre en el probador de microtensión. Marcas grabadas con láser muestran la central del soporte y 1,5 mm desde el extremo. Colocar una pequeña cantidad de adhesivo de cianoacrilato a base de gel en la línea central del soporte de acrílico y adherirse cuidadosamente una longitud de 1,5 mm de la muestra de implante para el soporte y la superposición de la línea central marcada (Figura 3). Cada muestra de implante requiere de un soporte de acrílico. Tenga cuidado para asegurar que el gel adhesivo permanece sólo a lo largo de la longitud de 1,5 mm de PVAc-NC está adherido a la acrtitular ylic. De lo contrario, el gel adhesivo puede interferir con el comportamiento mecánico de la muestra.
8. Retire la humedad de todas las muestras mediante la colocación de ellos en un desecador durante al menos 24 horas.
9. Medir la longitud, anchura, espesor y dimensiones de las muestras usando un microscopio óptico.

2. Establecer las condiciones ambientales

1. Cargar una muestra seca de configuración en el probador microtracción (véase la Figura 4), ​​primero de sujeción entre las mordazas móviles, a continuación, entre las mordazas fijas.
2. Montar un cepillo de aire con un depósito lleno de agua en una posición fija, con la boquilla dirigida hacia la muestra microtensión. Conectar el cepillo de aire de un compresor de aire a través de tubos de plástico. Con la boquilla de cepillo de aire completamente cerrada, encienda el compresor de aire.
3. Comience procedimiento de prueba microtensión cíclico, alternando entre el esfuerzo de tracción (tensión positiva) y la tensión a la compresión (presión negativa) aplicada a tque muestra, permaneciendo dentro de la región elástica lineal de la trama de tensión-deformación. Para PVAc-NC, la deformación aplicada está limitada a menos de 2%. En el probador microtensión personalizado utilizado en estos experimentos, la velocidad de deformación se controla mientras se midió la fuerza requerida para lograr que la cepa. Alternativamente, una configuración diferente podría implicar el control de la fuerza aplicada mientras que la medición de la tensión resultante.
4. Poco a poco aumentar el flujo de la boquilla de cepillo de aire, y vigilar la pendiente de la gráfica de tensión-deformación como una función de la cantidad de flujo desde el cepillo de aire. El caudal máximo que no causa una reducción significativa (> 10%) en el módulo de Young en un período de 60 segundos es el nivel que se utilizará para los experimentos ex vivo. En este punto, las condiciones de humedad que no mojar una muestra seca (y por lo tanto contribuir a una reducción en el módulo de Young), y también minimizar el secado de la muestra después de ser expuesto a los fluidos biológicos in vivo han sido thisblecido.
5. Medir la temperatura cerca de la muestra. Un ajuste ideal sería incluir un termopar con lectura digital, y se realiza mientras el aerógrafo está funcionando. Ajuste de la intensidad y la distancia de la fuente de calor radiante de modo que la temperatura de la muestra se mantiene a 37 ° C, para que coincida con las condiciones fisiológicas.

3. Comparación de Control Ambiental para el Control No ambiental

1. Muestras por instalación inmersión durante al menos 30 min en tampón fosfato salino. Después de este período de tiempo, la muestra está completamente saturada y se ha reducido al mínimo su módulo de Young a una temperatura dada.
2. Cargar rápidamente una muestra en el probador microtensión e iniciar las pruebas microtensión cíclica, con el pincel de aire, mientras se seca la muestra. Esto determinará la rapidez con que se seque la muestra en condiciones no controladas.
3. Cargue una segunda muestra de configuración PBS-saturada en el probador microtensión, e iniciar las pruebas microtensión cíclicacon el pincel de aire en. Esto determinará la rapidez con que se seque la muestra en condiciones ambientales controladas.

4. La implantación de sondas y explantación

1. Adjuntar muestra de implante a una abrazadera micromanipulador y la posición ortogonal con respecto al tejido cortical.
2. Antes de la inserción, mantener el tejido suficientemente húmeda con solución salina para asegurar la homogeneidad de la mecánica del tejido.
3. Baje la muestra de polímero en la corteza utilizando los controles manuales micromanipulador. Agregar muestra en tejido cortical hasta que el tiempo de implante objetivo, generalmente entre 1 y 30 min. Para evitar que el tejido se seque por momentos durante 5 minutos, pase suavemente el tejido cada 5 minutos con un algodón embebido en solución salina.
4. Mientras que la sonda se implanta en la corteza, preparar el probador de microtracción para la carga de la muestra actualmente implantado mediante el establecimiento de la varilla de accionamiento a la posición de desplazamiento cero de 3,0 mm a partir de la abrazadera de la muestra estacionaria. Además, ponga la boquilla de cepillo de airepara el ajuste del caudal y la fuente de calor radiante a la intensidad adecuada determinar en el paso 2.4.
5. Al final del tiempo de implante especificado, elevar la sonda de la corteza utilizando los controles manuales micromanipulador. Inmediatamente, y con cuidado, retire la muestra de la abrazadera micromanipulador y cargar en el probador de microtracción, como se describe en más detalle en el Paso 5.2.

5. Pruebas Microtracción de muestras de implantes

1. Para ahorrar tiempo después de la explantación, asegúrese de que el probador de microtensión está completamente listo para aceptar la muestra de implante antes de la implantación, tal como se describe en el paso 4.4.
2. Inmediatamente después de la explantación, cargar la muestra entre los dos conjuntos de abrazaderas probador microtracción. Dado que la muestra se monta en un soporte de acrílico diseñado para servir como la mitad superior de una de las pinzas, colocar el conjunto de muestra de implante en la empuñadura, lado de la muestra móvil hacia abajo. Es importante asegurarse de que está montada la muestra de tal manera que la cepa es aplied sólo a lo largo de la longitud de la sonda para evitar la aplicación de par de torsión a la muestra durante la prueba. Como tal, la muestra debe ser montado en el centro de cada abrazadera, y las abrazaderas debe estar a nivel con respecto a la otra.
3. Ajustar la posición de la muestra de tal manera que la distancia entre las abrazaderas es 3,0 mm, y el extremo de la sonda se coloca en la mordaza fija. Esta longitud de 3,0 mm entre las abrazaderas es la longitud de referencia para la muestra, y se utiliza en los cálculos posteriores para determinar la tensión en la muestra.
4. Inmediatamente después de obtener la muestra entre las dos pinzas, y dentro de 2 minutos de la explantación del tejido neural, activar el motor en la dirección de tracción para alargar la muestra a una velocidad constante (10 m / seg utilizados aquí), mientras que simultáneamente medir y registrar la elongación de la muestra (usando un indicador de desplazamiento, Mitutoyu 543-561) y la fuerza asociada (usando una célula de carga, Técnicas Transductor MDB-2.5) requerido para tensar la muestra.
6. Repita la prueba de microtensión para cada muestra y / o cada conjunto de condiciones (es decir, tiempo de inserción).

6. Análisis de Datos

1. Convertir los datos de elongación primas a deformación de ingeniería aplicada a la muestra implante dividiendo la distancia de la elongación por la longitud de referencia inicial, como se describe en la Ecuación 1, donde ε es la deformación aplicada, t es el tiempo, d es el desplazamiento medido por el micrómetro indicador y _L0 es la longitud de referencia inicial de la muestra:
   (1)
2. Convertir los datos de la fuerza primas a la tensión de ingeniería en la muestra dividiendo la fuerza (en Newtons), por la TRAárea de sección transversal nsverse, tal como se describe en la Ecuación 2:
   (2)
   donde σ es la tensión en la muestra, F es la fuerza medida por la célula de carga (en Newtons), w ₀ es la anchura inicial de la muestra, y t ₀ es el espesor inicial de la muestra.
3. Trazar la tensión (σ [t]) vs deformación (ε [t]) curva para cada muestra usando un programa de computadora, tales como Microsoft Excel.
4. Aislar la parte elástica lineal de la trama y el uso de herramientas de ajuste de curvas basadas en software para encontrar la mejor línea de ajuste de esta parte. La pendiente de la línea de mejor ajuste corresponde al módulo de la muestra de Young. La porción aislada de la trama debe incluir por lo menos 10 puntos de tensión-deformación, y debe ser tomada de la parte de la parcela donde la pendiente es mayor.
5. Para los ensayos cíclicos, tendrá que ser determinado para cada ciclo el módulo de Young. Esto puede ser automatizado o lleva a cabo manualmente.
6. Para los ensayos cíclicos, parcela el módulo de Young de cada ciclo en función del tiempo. Esto indica cómo cambia el módulo medido con el tiempo, lo cual es indicativo de la rapidez con una muestra de configuración está mojando o secado.
7. Para las muestras de implantes, cada muestra y el tiempo de implante corresponde a un único ciclo de los ensayos cíclicos. Mida el módulo de Young utilizando el procedimiento descrito anteriormente para cada muestra de implante.
8. Trazar el módulo de Young en función del tiempo de implante. En este punto, se pueden hacer comparaciones para las investigaciones de sobremesa, etc

Results

Las propiedades mecánicas de casi todos los materiales poliméricos, incluyendo nuestra PVAc-NC, dependen de la exposición a las condiciones ambientales. Más notablemente, estos incluyen la exposición al calor y la humedad. Cuando un material se plastifica debido a la absorción de humedad, o se somete a una transición térmica, que muestra una reducción en el módulo de Young. En la preparación de la humedad y el medio ambiente de temperatura controlada para la muestra ex vivo caracterización mecánica, es importan...

Discussion

El avance de los sistemas microelectromecánicos biomédicos implantables (bioMEMS) para interactuar con los sistemas biológicos está motivando el desarrollo de nuevos materiales con propiedades altamente personalizable. Algunos de estos materiales están diseñados para mostrar un cambio en las propiedades del material en respuesta a un estímulo que se encuentra en el entorno fisiológico. Una clase recientemente desarrollada de materiales responde a la presencia de hidrógeno líquidos de formación de enlace (por ejemplo...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Oblea de silicona	Oblea
Lámina acrílica extruida	Professional Plastics	SACR 062EF	Espesor 0.062 "
Hoja de afeitar	McMaster-Carr	3962A3
Pinzas	McMaster-Carr	8384A47	# 5 punta
Super Glue Gel	Loctite	130380
Air Cepillo	Snap-on Compresor de	aire BF175TA
	Paasche B002YKN8YO		D500
Termopar	Omega	HH12A
	Cimarec	SP131325Q
láser de escritura directa de CO2	VersaLaser	3.5
Desecador	Fisher Scientific	08-595
Lámpara			Probador
		microtracción	a medida