El siguiente protocolo proporciona técnicas para encapsular las células β del páncreas en PEG-péptido crecimiento paso a hidrogeles formados por tiol-eno clic en la foto-reacciones. Esta plataforma de material no sólo ofrece un microambiente citocompatible para encapsulación de células, sino que permite también controlada por el usuario rápida recuperación de las estructuras celulares formadas dentro de los hidrogeles.
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Artículo de método
Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles
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Resumen
Resumen
Los hidrogeles son polímeros reticulados hidrófilos que proporcionan un microentorno tridimensional con tejido-como elasticidad y alta permeabilidad para el cultivo de células o tejidos terapéuticamente relevantes. Los hidrogeles preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) derivados se utilizan cada vez más para una variedad de aplicaciones de ingeniería de tejidos, en parte debido a sus propiedades sintonizables y citocompatible. En este protocolo, se utilizó tiol-eno de crecimiento paso a photopolymerizations para fabricar PEG-péptido hidrogeles para encapsular pancreático MIN6 células b. Los geles fueron formados por PEG-norborneno 4-brazo (PEG4NB) macrómero y un agente de reticulación péptido con quimotripsina sensible (CGGYC). La naturaleza hidrófila y no la formación de incrustaciones de PEG ofrece un microambiente citocompatible para la supervivencia y la proliferación celular en 3D, mientras que el uso de la secuencia del péptido con quimotripsina sensible (C GGY ↓ C, flecha indica el sitio de escisión de enzima, mientras que el quiste terminalesresiduos eine se añadieron para tiol-eno reticulación) permite una rápida recuperación de los constructos de células que forman dentro del hidrogel. El siguiente protocolo elabora técnicas para: (1) La encapsulación de MIN6 β-células en tiol-eno hidrogeles, (2) ensayos de células cualitativos y cuantitativos de viabilidad para determinar la supervivencia y la proliferación celular; (3) Recuperación de esferoides de células usando quimotripsina mediada gel erosión, y (4) Análisis estructural y funcional de los esferoides recuperados.
Introducción
Los hidrogeles son polímeros hidrófilos reticulados con un potencial excepcional como los materiales del armazón para tejidos reparación y regeneración. 1-3 El alto contenido de agua de los hidrogeles permite la fácil difusión de oxígeno y el intercambio de nutrientes y productos metabólicos celulares, todas las cuales son cruciales para mantener la viabilidad celular. Además, los hidrogeles son excelentes portadores para la liberación controlada y suministro de células debido a su alta capacidad de ajuste. 2 hidrogeles sintéticos tales como los preparados a partir de poli (etilenglicol) (PEG) se utiliza cada vez más en aplicaciones de ingenierí....
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Protocolo
A. Síntesis de péptidos y Macrómero
- Sintetizar 4-brazo PEG-norborneno (PEG4NB) y arylphosphanate fotoiniciador de litio (LAP) utilizando protocolos establecidos. 18,19
- Sintetizar bis-cisteína que contiene quimotripsina sensible al péptido CGGY ↓ C (la flecha indica el sitio de escisión quimotripsina) utilizando estándar de síntesis de péptidos en fase sólida en un sintetizador de péptidos de microondas (CEM Discover SPS).
- Calcular la cantidad de resina (Rink-amida resina MBHA) necesario en base a la relación de sustitución de la resina y la escala de síntesis. Hinchar la resina en dimetilformamida (DMF) en un re....
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Resultados
Las figuras 1-4 muestran los resultados representativos para la encapsulación, la supervivencia, la proliferación, la formación de esferoides, y la recuperación esferoide en tiol-eno hidrogeles. Figura 1 muestra el esquema de reacción de (1) por crecimiento en etapas tiol-eno fotopolimerización usando PEG4NB y CGGYC, y ( 2) quimotripsina erosión gel mediada que sigue un mecanismo de erosión de la superficie. Figuras 2 y 3 los resultados de viabili.......
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Discusión
El protocolo descrito presenta detalles sobre la encapsulación fácil de células en tiol-eno hidrogeles formados por fotopolimerización por crecimiento en etapas. Mientras que una relación estequiométrica de 1:1 de norborneno de grupos funcionales tiol se utilizó en este protocolo, la relación puede ser ajustada dependiendo de los experimentos. Además de una formulación correcta, es importante para mantener la homogeneidad en la solución de pre-polímero. En particular, el uso pipeteo suave para asegurar que las células e.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de interés declarado.
Agradecimientos
Este proyecto fue financiado por el NIH (R21EB013717) y IUPUI OVCR (RSFG). El autor agradece a la Sra. Han Tzu por su asistencia técnica.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre | Empresa | Número de Catálogo | Comentarios |
| 4-brazo PEG (20 kDa) | Jenkem Tecnología de EE.UU. | 4ARM-PEG-20K | |
| Fmoc-aminoácidos | Anaspec | ||
| Live / Dead celular kit de viabilidad | Invitrogen | L3224 | Incluye calceína AM y homodímero de etidio-1 |
| AlamarBlue reactivo | AbD Serotec | BUF012 | |
| CellTiter Glo reactivo | Promega | G7570 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | Sin Ca +2 y Mg +2 |
| HBSS | Lonza | 10547F | SinCa +2 y Mg +2 |
| DMEM alto en glucosa | Hyclone | SH30243.01 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| Antibiótico-antimicótico | Invitrogen | 15240-062 | |
| β-mercaptoetanol | Sigma-Aldrich | M7522-100ML | |
| Tripsina-EDTA | Invitrogen | 15400-054 | |
| Tripsina libre de α-quimotripsina | Worthington Biochemical Corp | LS001432 | |
| Ratón Inusin kit ELISA | Mercodia | 10-1247-01 | |
| 1 ml jeringa desechable | BD Biosciences |
Referencias
- Tibbitt, M. W., Anseth, K. S. Hydrogels as extracellular matrix mimics for 3D cell culture. Biotechnology and bioengineering. 103, 655-663 (2009).
- Lin, C. C., Anseth, K. S. PEG hydrogels for the controlled release of biomolecules in regenerative....
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Reimpresiones y permisos
