En tiempo real de análisis de transporte de retinol en el receptor de la membrana de plasma Proteína Fijadora del Retinol

Resumen

Aquí describimos una técnica optimizada para producir alta calidad complejo de vitamina A / RBP y dos técnicas en tiempo real de seguimiento para estudiar la vitamina A por STRA6 transporte, el receptor de las prácticas comerciales restrictivas.

Resumen

La vitamina A es esencial para la visión y el crecimiento / diferenciación de casi todos los órganos humanos. Plasma proteína de unión a retinol (RBP) es el principio y el soporte específico de la vitamina A en la sangre. Aquí se describe una técnica optimizada para producir y purificar holo-RBP y dos en tiempo real de técnicas de supervisión para estudiar el transporte de vitamina A por el receptor de alta afinidad RBP STRA6. La primera técnica hace que sea posible producir una gran cantidad de alta calidad holo-RBP (100%-cargado con retinol) para la vitamina A ensayos de transporte. RBP de alta calidad es esencial para ensayos funcionales porque misfolded RBP versiones vitamina contaminación bacteriana y fácilmente en la preparación RBP pueden causar artefactos. En tiempo real las técnicas de vigilancia como la electrofisiología han hecho contribuciones importantes a los estudios de transporte de membrana. La RBP receptor mediada por el transporte de retinol no se ha analizado en tiempo real hasta hace poco. La segunda técnica descrita aquí es la razónl análisis en tiempo de STRA6 catalizada por la liberación de retinol o de carga. La tercera técnica es analizar en tiempo real de STRA6 catalizada por transporte de retinol holo-RBP para celular proteína de unión a retinol I (CRBP-I). Estas técnicas proporcionan una alta sensibilidad y resolución en la revelación de receptor de la vitamina del RBP un ​​mecanismo de absorción.

Introducción

La vitamina A es una molécula orgánica que es esencial para la supervivencia y el buen funcionamiento de casi todos los órganos humanos. Derivados de vitamina A (retinoides) participar en diversos eventos bioquímicos y celulares, incluyendo la detección de luz de ^1,2 visión y la regulación de la expresión génica y la traducción de la proteína durante el desarrollo embrionario y en los tejidos adultos ^3-6. Aunque retinol tiene la capacidad de difusión en forma sistémica, evolución subió con plasma proteína de unión a retinol, una proteína portadora específica para la vitamina A de transporte en la sangre para lograr una alta eficiencia y especifi....

Protocolo

1. Producción, replegamiento y purificación por HPLC de holo-RBP

1. Transformar BL-21cells con el vector pET3a que alberga el cDNA humano para RBP con 6x His en el extremo N-terminal. Cultivar las transformadas BL-21 células en un agitador a 37 ° C en 40 ml de medio LB con carbenicilina hasta que la DO a 600 nm alcanza 0,5. Inducir la expresión de proteínas RBP mediante la adición de IPTG a 1 mM. Crecer las bacterias a 37 ° C otra 5 hr.
2. RBP producida en E. coli es en su mayoría presentes en cuerpos de inclusión insolubles. Para enriquecer los cuerpos de inclusión, las células de pellets a 10.000 xg durante 20 min. Entonces sonicar las célul....

Resultados

Presentamos aquí los resultados representativos de holo-RBP producción y purificación por HPLC (Figura 1), análisis en tiempo real de STRA6 catalizada por la liberación de retinol holo-RBP y la carga de retinol en apo-RBP (Figura 2) y el análisis en tiempo real de STRA6 catalizada retinol transporte de holo-RBP a EGFP-CRBP-I (Figura 3).

Sin replegamiento, RBP producida en bacterias es casi completamente plegadas incorrectamente debido a la p.......

Discusión

Compartimos aquí un protocolo RBP producción optimizada por prácticas comerciales restrictivas procedimientos de producción y purificación son fundamentales para la generación de prácticas comerciales restrictivas correctamente plegada. Dada la posibilidad de que especies RBP mal plegadas y la presencia de cantidades traza de proteínas bacterianas incluso en HPLC purificada producidas por bacterias RBP, es útil usar RBP nativo a partir de suero para confirmar una conclusión relacionada con RBP. RBP orina, que está dispo.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo / material	Empresa	Número de Catálogo	Comentarios
hidrocloruro de guanidina	EMD	5010
cistina	Sigma	C8755
cisteína	Sigma	C7352
EDTA	Pescador	BP118-500
Tris	Pescador	7786-1
TDT	EMD	3860
retinol	Sigma	R7632
carbenicilina	Pescador	BP2648-5
IPTG	EMD	5810
PBS	EMD	6508
NaCl	Pescador	BP358-10
Ni-NTA	Qiagen	1018244
imidazol	EMD	5720
heptano	EMD	HX0295-1
Casein Blocker	Atravesar	37528
Amicon Ultra 15 concentrador (MWCO10 K)	Millipore	UFC901024
Microfluor-2 placa	Pescador	14-245-177
Hamilton jeringa hermética # 1710	Pescador	14-824-655