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Aislamiento y diferenciación de las células del estroma vascular a células Beige / Brite

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DOI:

10.3791/50191

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28 de marzo de 2013

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1UCSF Diabetes Center and Department of Cell and Tissue Biology, University of California, San Francisco , 2Department of Biology, University of Copenhagen, Denmark, 3National Institute of Nutrition and Seafood Research, Bergen, Norway

En este artículo

Resumen

Preadipocitos primarios blancas aisladas de tejidos adiposos blancos en ratones se pueden diferenciar en células beige / brite. Se presenta aquí un sistema fiable modelo celular para estudiar la regulación molecular de "color" de la grasa blanca.

Resumen

Adipocitos marrones tienen la capacidad de desacoplar la cadena respiratoria en las mitocondrias y disipar la energía química en forma de calor. Desarrollo de UCP1-positivas adipocitos marrones en los tejidos adiposos blancos (llamados células beige o brite) se induce por una variedad de señales ambientales tales como la exposición al frío crónica o por agonistas PPAR, por lo tanto, este tipo de célula tiene potencial como una diana terapéutica para tratamiento de la obesidad. Aunque la mayoría de inmortalizadas líneas de adipocitos no puede recapitular el proceso de "color" de la grasa blanca en cultivo, adipocitos primarios aislados de la fracción del estroma vascular en el tejido subcutáneo adiposo blanco (WAT) proporcionar un sistema celular fiable para estudiar el control molecular de desarrollo de las células beige / brite . Aquí se describe un protocolo para el aislamiento eficaz de los preadipocitos primarios y para inducir la diferenciación de células de color beige / brite en cultivo. El efecto de dorado se puede evaluar mediante la expresión de la grasa marrón selectivo marcaERS tales como UCP1.

Introducción

La obesidad es el aumento dramáticamente en todo el mundo y ahora se considera uno de los problemas más graves para la salud pública 1. Esta condición está relacionada con un desequilibrio en la ingesta de energía relativa a los gastos y resultados en el exceso de energía almacenada en forma de lípidos en el tejido adiposo blanco (WAT). WAT ampliada se asocia con una mayor masa corporal y el peso, mientras que el tejido adiposo marrón tiene la capacidad de disipar el exceso de energía para producir calor. Por lo tanto BAT puede funcionar como protección contra el frío y la obesidad 2,3. Esto se consigue mediante desacoplamiento del transporte de electrones en la mitocondria por la disociación de proteínas 1 (UCP1). Esta proteína se considera una característica de termogénesis sin BAT en 3. Varios estudios realizados en años recientes han revelado que los humanos adultos tienen funcional 4-8 BAT y, en consecuencia, la manipulación de las MTD en los seres humanos puede ser una intervención terapéutica potencial en la lucha contra la obesidad y sus enfermedades relacionadas.

jove_content "pruebas> actual indica que hay dos tipos de adipocitos marrones existen en los roedores;" clásica "o" pre-existentes "grasa parda se desarrolla durante la etapa prenatal y forma dedicados depósitos adiposos marrones en región interescapular y otros tejidos periféricos En la otra mano. , un "inducible" forma de grasa marrón (así llamadas células Brite o beige) se desarrolla durante la etapa post-natal y aparece intercaladas en el tejido adiposo blanco. Los dos tipos de adipocitos marrones también son separadas por diferentes orígenes del desarrollo. Si bien la pre-existente adipocitos marrones surgen de myoblastsic-Myf5 como precursores, los inducibles brite / beige células intercaladas en WAT surgen de un linaje no Myf5 9,10. Además, las vías de regulación de este tipo de célula es probable que sea diferente de la marrón Myf5 derivado adipocitos 11. El desarrollo de las células de color beige (es decir, "cambio de color" blanco de grasa) puede ser activada en respuesta a la exposición al frío y crónica aβ3-adrenérgicos agonistas o agonistas de PPAR en adultos 12-14. Las células de color beige / brite es probable que sean un objetivo terapéutico prometedor para la manipulación de balance global de energía y, potencialmente, puede convertirse en parte del tratamiento de la obesidad, por lo que es importante para comprender los mecanismos moleculares precisos y vías de señalización por señales ambientales que controlan el desarrollo de color beige las células.

Para comprender el control molecular de la pardeamiento de la grasa blanca, en experimentos in vitro son los más adecuados como la diferenciación de los preadipocitos tiene lugar más bien de forma asíncrona y es difícil de detectar las células in situ 15. Aunque los estudios sobre el desarrollo de los adipocitos hasta ahora se han realizado principalmente en líneas celulares tales como, 3T3-L1 3T3-F442A o HIB1, estas líneas celulares parecen carecer de la firma molecular de las células de color beige. Por otro lado, los adipocitos primarios aislados desde la inyección subcutánea WAT ​​tienen más probabilidades de recapitular los process de pardeamiento de la grasa blanca de forma autónoma celular. Aquí se proporciona un protocolo para el aislamiento eficaz de la fracción estromal-vascular de tejidos adiposos y para inducir el bronceado de grasa blanca en respuesta a los agonistas de PPAR. Rosiglitazona se ha demostrado que es un mediador especialmente eficaz de pardeamiento en estas células. Como se sugirió anteriormente 16, este sistema celular se puede utilizar para servir a un sistema fiable celular para estudiar el desarrollo de las células de color beige / brite.

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Protocolo

1. Preparar Medio Digestión

Hacer 5 ml por 5 ratones por tejido (aproximadamente 1 ml / 1 g de tejido adiposo).

  1. Pesar de las enzimas de digestión:
    - Colaginasa D: 1,5 u / ml (1108874103, 1 g, Roche, 70334223)
    - Dispase II: 2,4 u / ml (04942078001, 0.980 mg / lyo, Roche, 11466200)
  2. Añadir 25 ml de PBS y mezclar bien para disolver
  3. Añadir CaCl 2 justo antes de la digestión de los tejidos a una concentración final de 10 mM

2. Disecar el tejido adiposo de ratones

  1. La disección debe realizarse con cuidado, e inmediatamente después de los ratones (6-8 semanas de edad) se sacrificaron. El trabajo estéril con etanol rociado en la piel del ratón antes de abrirlo. Coloque el tejido directamente en PBS limpio, BAT y subcutánea interescapular separado inguinal WAT.
  2. Para BAT interescapular: tiene el ratón colocado con la parte posterior enfrentado, corte a lo largo de la parte posterior abierta y todo el camino hasta el cuello. El marróntejido adiposo se encuentra justo debajo de la piel entre los hombros (interescapular). BAT se puede ver como dos lóbulos en forma de mariposa. Una fina capa de grasa blanca que cubre el BAT debe ser cuidadosamente eliminado.
  3. Para subcutánea WAT ​​(inguinal WAT): quitar la piel. El inguinal se encuentra directamente debajo de la piel en ambos lados, comenzando casi en la parte posterior y va al lado, en el interior de los muslos y hacia abajo, hacia el testículo.

3. Cortar y digerir el tejido adiposo

  1. Rápidamente eliminar toda contaminación, como el pelo, el músculo esquelético y el tejido conectivo de las secciones de tejido.
  2. Seque los tejidos rápidamente en un papel para no diluir medio disección con PBS y colóquelo en un plato seco.
  3. Añadir medio de digestión (añadió CaCl 2 antes de la digestión) y picar el tejido en trozos pequeños. Mezclar bien pipeteando arriba y abajo con una pipeta de 5 ml. Transferir los tejidos picados en tubos de 50 ml con el resto de la digestión medio, mezclar aún más pipeteando arriba y abajo.
  4. Colocación en 37 ° C con agitación constante a 150 rpm durante 40-50 min. Compruebe cada 10-15 minutos para asegurarse de que la digestión va bien y evitar el exceso de digestión.

Nota: media digestión correcta y el tiempo son importantes. El tejido tiene que ser digerido bien, pero la digestión exceso puede dañar las células.

4. Suspensión de células filtro

  1. Detener la digestión por la adición de 5 ml de medio completo (DMEM/F12 que contiene FPS 10% y P / S). Las células deben ser casi completamente homogénea. Mezclar bien pipeteando.
  2. Centrifugar a 700 xg durante 10 min.
  3. SVF ahora puede ser visto como un sedimento de color marrón en el fondo del tubo. Aspirar la capa aceitosa en la parte superior de adipocitos maduros y la mayor parte de la capa de líquido - mantener el sedimento y se disuelven en 10 ml de medio completo. Mezclar bien.
  4. Coloque un filtro de células (50-70 m de diámetro) en un nuevo 50 ml tubo y se filtra la suspensión celular.

5. Células de la placa

  1. Transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml y centrifugar a 700 xg durante 10 min.
  2. Aspirar el medio y el sedimento vuelva a suspender en 10 ml de medio completo. Pipeta y mezclar bien.
  3. Estimar cuántos platos se necesitan. Esto puede variar y depende del tamaño de los gránulos. Una regla general es de 2 placas de 10 cm a partir de 5 ratones para WAT ​​inguinal y una placa de 10 cm para las MTD.
  4. Células de la placa en los platos recubiertos de colágeno (I + D) en medio completo
  5. 1-2 h después de la siembra de las células, el medio aspirado, lavar dos veces con PBS y se añade medio fresco. Este paso es importante ya que puede eliminar las células rojas de la sangre, células inmunes y otros contaminantes.

6. Diferenciar las células

  1. Hacer mantenimiento y medios de inducción.

Medio de mantenimiento

Completar con medio ha añadido:

ent "> La insulina, conc. 5 mg / ml (5 mg / ml, *** 100 l de ácido acético en 10 ml de H 2 O para preparar pH se acidifica el agua 2.5. disolver la insulina en el agua acidificada. stock en la tienda -20 ° C)

3,3 ',5-triyodo-L-tironina (T3), conc. 1 nM (10 mM acciones, *** disolver T3 en 1N NaOH y se añade medio de acciones para hacer 10 m. Sigma cat # T-2877)

Almacenar a 4 ° C, bien por una semana

Medio de inducción

Mantenimiento de medio que contiene los siguientes compuestos:

Indometacina, conc final. 125 mM de stock (0,125 M en etanol, Sigma cat # I-7378). La indometacina se debe calentar a 60 ° C para disolver.

Dexametasona, conc final. 2 mg / ml (2 mg / ml en etanol calcetín, Sigma cat # D-1756)
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), conc. 0,5 mM (0,25 M de stock en DMSO, Sigma cat # I-5879)
La rosiglitazona, final conc. 0,5 mM(10 mM de existencias en DMSO, Sigma cat # R-2408)

Nota: Asegúrese de inducción medio fresco cada vez.

  1. Grow adipocitos primarios a 95-97% de confluencia en medio completo (confluente pero no demasiado lleno)
  2. Cambio de medio completo regular con medio de inducción (día 0)
  3. Después de 48 horas (día 2), cambiar medio a medio de mantenimiento con rosiglitazona (0,5 mM)
  4. Después de más de 48 horas (día 4), cambie al medio de mantenimiento fresco con rosiglitazona (1 mM) para 2-3 días adicionales. 6-7 días después de añadir el medio de inducción, las células están totalmente diferenciadas a células adiposas maduras y están llenos de gotas de aceite. Las gotas aparecerá alrededor de 3-4 días después de la inducción.

Nota: Cambio medio cada 2-3 días hasta que las baterías están completamente diferenciados.

Las células pueden ahora ser cosechado y la expresión de ARNm de UCP1 y otheR Brown adipocito específicos de los genes se puede medir por qRT-PCR. Western blot se utiliza para detectar proteínas.

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Resultados

Browning de adipocitos primarios se puede acceder mediante la medición de la expresión de ARNm de UCP1 y otros genes de la grasa marrón-específicos o selectivos de QRT-PCR. Presentado en la Figura 1 son los datos de expresión génica en el inguinal-derivados adipocitos primarios. Las células fueron inducidas a diferenciarse en la presencia de dos diferentes dosis de rosiglitazona en 50 nm y 500 nm, respectivamente. Un subconjunto de células se trató con forskolina en 10 mM durante 4 horas antes ...

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Discusión

Aquí presentamos un sistema fiable celular para estudiar el desarrollo de las células de color beige / brite en la enseñanza primaria adipocitos cultivados en ratones. En comparación con varias líneas celulares inmortalizadas disponibles, este sistema es probable que ofrezca mayor relevancia para el pardeamiento de la grasa blanca in vivo.

A pesar de que el estudio de estos adipocitos primarios ofrece algunas ventajas, también existen algunas limitaciones y preocupaciones que son im...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses en conflicto financieros.

Agradecimientos

Damos las gracias a Haruya Ohno, Shinoda Kosaku, Sharp Louis, Tomoda Emi, y Lauren Ruiz de discusión, ayuda técnica y asistencia editorial sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por becas de los NIH (DK087853), del Programa de Investigación Biomédica y de Breakthrough Asubio Pharm Inc. para SKULA fue apoyado por una COMPARTIR becas de doctorado de la Universidad de Copenhague y la UE FP7 proyecto Diabat (SALUD-F2 -2,011-278.373) a Lise Madsen y Kristiansen Karsten. También reconocemos la DERC centro subvención (NIH P30 DK063720).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Reactivo
Colaginasa D Roche 11088874103
Dispasa II Roche 04942078001
CaCl 2
Medio DMEM Pescador 10017-CV Con 2,5 g / l de glucosa y L-glutamina sin piruvato de sodio
Insulina
T3 (3,3 ',5-triyodo-L-tironina) Sigma T-2877
La indometacina Sigma I-7378
Dexametasona Sigma D-1756
IBMX Sigma I-5879
Rosiglitazona Sigma R-2408
Equipo
Colágeno platos recubiertos BD 354450 Placas de 10 cm
70 micras filtro BD Falcon 352350 Celular colador, 70 m nylon 1/ea

Referencias

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