Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en

10.3K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/50201

⸱

19 de febrero de 2013

 ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Technical University of Berlin, 2The Vollum Institute, Oregon Health & Science University

En este artículo

Resumen

Describimos un método para cuantificar la actividad de las ATPasas de tipo P que contratransportan K+ mediante la expresión heteróloga de las enzimas en los ovocitos de Xenopus y midiendo la absorción de Rb+ o Li+ en células individuales mediante espectrofotometría de absorción atómica. El método es una alternativa sensible y segura a los experimentos de flujo de radioisótopos, ya que facilita estudios cinéticos complejos.

Resumen

Mientras que el transporte catiónico por el transportador de membrana electrogénica Na+,K+-ATPasa puede medirse mediante electrofisiología, la H+,K+-ATPasa gástrica que opera electroneutralmente es más difícil de investigar. Muchos ensayos de transporte utilizan radioisótopos para lograr una relación señal-ruido suficiente, sin embargo, las medidas de seguridad necesarias imponen severas restricciones con respecto a la exposición humana o el diseño del ensayo. Además, el transporte de iones a través de las membranas celulares está críticamente influenciado por el potencial de membrana, que no se controla directamente en el cultivo celular o en las preparaciones de proteoliposomas. Aquí, hacemos uso de la extraordinaria sensibilidad de la espectrofotometría de absorción atómica (AAS) hacia trazas de elementos químicos para medir el transporte de Rb+ o Li+ por Na+, K+- o H+,K+-ATPasa gástrica en células individuales. Utilizando ovocitos de Xenopus como sistema de expresión, determinamos la cantidad de Rb+ (Li+) transportado a las células midiendo muestras de homogeneizados de un solo ovocito en un dispositivo AAS equipado con un horno atomizador de grafito (THGA) calentado transversalmente, que se carga desde un muestreador automático. Dado que el contexto de la absorción inespecífica de Rb+ en los ovocitos de control o durante la aplicación de inhibidores específicos de ATPasa es muy pequeño, es posible implementar esquemas de ensayos cinéticos complejos que involucran un gran número de condiciones experimentales simultáneamente, o comparar la capacidad de transporte y la cinética de los transportadores mutados específicos del sitio con alta precisión. Además, dado que la absorción de cationes se determina en células individuales, los experimentos de flujo se pueden llevar a cabo en combinación con la sujeción de voltaje de dos electrodos (TEVC) para lograr un control preciso del potencial y la corriente de la membrana. Esto permitió, por ejemplo, determinar cuantitativamente la estequiometría de transporte 3Na+/2K+ de la Na+,K+-ATPasa y permitió, por primera vez, investigar la dependencia de voltaje del transporte catiónico por la H+,K+-ATPasa gástrica que opera electroneutralmente. En principio, el ensayo no se limita a las proteínas de membrana transportadoras de K+, pero puede funcionar igualmente bien para abordar la actividad de los transportadores de metales pesados o de transición, o la absorción de elementos químicos por procesos endocitóticos.

Introducción

Queríamos desarrollar una alternativa sensible, segura y barata a los experimentos con trazadores radiactivos para investigar la actividad de transporte específica de las proteínas de membrana con translocación de iones con el fin de eludir las restricciones relacionadas con el acceso a los laboratorios de isótopos, los requisitos de seguridad o el uso de radioisótopos costosos, que - como en el caso del litio - pueden incluso no estar disponibles debido a tiempos de desintegración extremadamente cortos. Estábamos particularmente interesados en determinar la actividad de la H+,K+-ATPasa gástrica que opera electroneutramente, porque la enzima no genera corriente y, por lo tanto, su actividad no puede abordarse mediante métodos electrofisiológicos. Dado que el Na+,K+- y el H+,K+-ATPasa transportan Rb+ tan eficiente como el K+ (y también el Li+), la alta sensibilidad de la técnica AAS para el rubidio o el litio debería facilitar la detección sensible de la actividad de transporte. Los espectrofotómetros de absorción atómica son dispositivos analíticos comunes, que están ampliamente distribuidos en los laboratorios químicos y deberían ser accesibles a un gran número de científicos interesados. Además, quisimos aprovechar el sistema de expresión de ovocitos de Xenopus, que utiliza células individuales de gran tamaño (alrededor de 1,0-1,5 mm de diámetro) que permiten lograr una variabilidad célula a célula notablemente baja con respecto al nivel de expresión de proteínas dentro de un solo lote. Un simple cálculo demuestra la viabilidad del ensayo AAS: el límite de detección (masa característica) para el rubidio con la técnica THGA-AAS es de 10 pg o 1,2,10-13 mol (Rb: 85,47 g/mol), para el litio 5,5 pg o 7,9,10-13 mol (Li: 6,94 g/mol). Tras la expresión heteróloga de Na+,K+-ATPasa en ovocitos de Xenopus, se pueden alcanzar corrientes de bombeo de 100 nA (lo que equivale a unas 6,2,1011 cargas elementales por segundo, o 1,03,10-12 mol s-1), lo que da como resultado un transporte de 6,10-6 C de carga en 1 min. Dado que el transporte de una carga neta corresponde a la absorción de dos iones Rb+ (debido a la estequiometría 3Na+/2K+), una corriente de 100 nA durante 1 min corresponde a una absorción de 1,2·10-10 mol Rb+. Por lo tanto, incluso con una dilución de 1.000 veces (homogeneización de un ovocito con un volumen de aproximadamente 1 μl en 1 ml de agua), una muestra típica de THGA-AAS (20 μl) contiene 2,4,4,10-12 moles de Rb+ (o 204 pg), que está muy por encima del umbral de detección. Por lo tanto, incluso los transportadores con una actividad de transporte o expresión de membrana plasmática más de 100 veces menor se pueden ensayar con la técnica ajustando adecuadamente el tiempo de flujo del experimento.

Dado que la velocidad de bombeo depende sensiblemente de la temperatura (las energías de activación típicas para Na+,K+-ATPasa están en el rango de 90 kJ/mol a 130 kJ/mol1-3, lo que resulta en un aumento de aproximadamente el 30% en la tasa de rotación al cambiar de 20 °C a 22 °C), es obligatorio realizar las mediciones de flujo bajo un control de temperatura preciso (aire acondicionado) con soluciones tampón bien equilibradas. Además, los ovocitos deben seleccionarse cuidadosamente en función del tamaño homogéneo para la expresión de un transportador de iones. Con estas precauciones, es posible lograr rutinariamente errores estándar experimentales de menos del 10 por ciento con aproximadamente 10 células por condición experimental. Utilizando esta técnica, pudimos determinar, por ejemplo, las afinidades aparentes de Rb+ del transporte catiónico4-6, la influencia del pH extracelular e intracelular7 y el efecto de las mutaciones de los residuos implicadas en la coordinación catiónica durante el transporte4,8. Una ventaja de la técnica es que los flujos de iones también se pueden determinar en combinación con la sujeción de voltaje de dos electrodos de los ovocitos, lo que, por un lado, asegura un control preciso del potencial de membrana durante el transporte y, por otro lado, permite correlacionar el flujo de iones con la corriente de membrana. Así, fue posible verificar la estequiometría 3Na+/2K+ de la Na+,K+-ATPasa (ver resultados ejemplares a continuación) y determinar la dependencia de voltaje del transporte catiónico de la H+/K+-ATPasa gástrica7.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

1. Construcciones de ADNc y expresión de proteínas en ovocitos de Xenopus

El ADNc de la proteína de membrana de interés debe clonarse en un vector adecuado para la expresión en ovocitos de Xenopus laevis, como pTLN9 o pcDNA3.1X10. Dichos vectores optimizados contienen las regiones no traducidas (UTR) 5' y 3' del gen β-globina de Xenopus laevis que flanquean el sitio de clonación múltiple (MCS), una secuencia promotora de ARN polimerasa (pTLN: SP6, pcDNA3.1X: T7) ubicada antes del UTR 5', un tramo de poli-A en dirección 3' del MCS para garantizar la estabilidad del ARNc en las células, y más abajo otra secuencia de sitios de endonucleasas de restricción de corte único para la linealización del plásmido, con el fin de que sirva como molde para la transcripción in vitro de ARNc.

Para distinguir la actividad de la Na+/K+-ATPasa humana sobreexpresada (subunidad α2 + subunidad β1) de la Na+/K+-ATPasa endógena de los ovocitos, se introdujeron las mutaciones Q116R y N127D para obtener una proteína resistente a la ouabaina con una IC50 en el rango de milimolar11. En el caso de la H+/K+-ATPasa, las mediciones de flujo se realizaron utilizando el mutante S806C de la subunidad α de la H+/K+-ATPasa, ya que los flujos de Rb+ se correlacionaron con datos cinéticos procedentes de experimentos de fluorometría con bloqueo de voltaje (VCF). La técnica de VCF (https://www.jove.com/video/2627/ examining-the-conformational-dynamics-of-membrane-proteins-in-situ-with-site-directed-fluo rescence-labeling)12 se basa en la unión específica a un residuo de cisteína introducido estratégicamente de un fluoróforo, que reporta los cambios conformacionales de la enzima.

2. Linealización y purificación de la plantilla de ADN

  1. Para la linealización de la plantilla de ADN, digiera 3 μg de ADN plasmídico en un volumen de reacción de 50 μl con 5 μl de tampón concentrado 10x adecuado para la enzima de restricción y 10 U de enzima de restricción durante 1 h a 37 °C.
  2. Purifique el ADN linealizado utilizando el High-Pure PCR Product Purification Kit (Roche Applied Science). Primero, añada 350 μl de tampón de unión (que contiene guanidinioisotiocianato) al vial de digestión. Tras este paso de purificación, la plantilla de ADN linealizado es de "calidad para ARN" porque el guanidinioisotiocianato es un desnaturalizante proteico eficaz y destruye especialmente la ARNasa, que es un contaminante frecuente en laboratorios de biología molecular.
  3. Coloque las columnas de centrifugación en tubos colectores, cargue la columna con la solución de ADN del paso 2, centrifugue a 13.000 x g durante 30 s y deseche el flujo pasante.
  4. Añada 500 μl de tampón de lavado a la columna. Centrifugue 1 min a 13.000 x g y deseche el flujo pasante.
  5. Añada 200 μl de tampón de lavado a la columna. Centrifugue 1 min a 13.000 x g para secar completamente la columna.
  6. Coloque la columna de centrifugación en un tubo Eppendorf nuevo de 1,5 ml y añada 50 μl de agua libre de nucleasas (Ambion Producto # AM9937) a la columna. Eluya mediante centrifugación durante 1 min a velocidad máxima.
  7. Tras la elución, concentre la solución que contiene ADN hasta aproximadamente 15 μl. Este paso asegura que la solución contenga 0,5 μg de ADN linealizado en 3 μl, que es la concentración recomendada para la siguiente reacción de transcripción in vitro de cARN.

3. Síntesis de cRNA In Vitro

  1. Seleccione el kit mMessage mMachine adecuado (Ambion Producto #1340, #1344) según la secuencia del promotor en el plásmido (SP6, T7). En un volumen total de reacción de 10 μl, añada 3 μl de ADN linealizado del paso anterior y 1 μl de tampón de transcripción a muestras previamente alícuotadas de 5 μl de la mezcla NTP-cap. Es necesario alícuotar previamente la mezcla NTP-cap para evitar ciclos repetidos de congelación-descongelación, que podrían provocar la degradación de los nucleósidos trifosfato. Finalmente, añada 1 μl de la ARN polimerasa adecuada, mezcle brevemente y centrifugue brevemente la mezcla de reacción.
  2. Incube la mezcla de reacción durante 1 a 2 horas a 37 °C. El tiempo de incubación no debe exceder las 2 horas, ya que esto podría reducir el rendimiento o la calidad del cARN.
  3. Añada 15 μl de solución de LiCl 3 M fría (a temperatura de hielo) del kit, 15 μl de agua fría libre de nucleasas, mezcle brevemente (no agite por vórtice), centrifugue brevemente la muestra a 11.000 x g durante 10 segundos y almacénela a -20 °C durante al menos 30 minutos para permitir la precipitación del cARN.
  4. Enfríe previamente la centrífuga a 4 °C y centrifugue al menos 15 minutos a 13.000 x g tras la precipitación.
  5. Retire cuidadosa y completamente el sobrenadante del pellet marrón pálido en el fondo del tubo y añada 150 μl de etanol al 70% de grado para ARN enfriado a -20 °C. Centrifugue a 4 °C durante 5 minutos a 13.000 x g.
  6. Elimine completamente el sobrenadante, seque brevemente (1-2 minutos) el pellet restante de cARN en un evaporador centrífugo (e.g. Eppendorf Concentrator modelo 5301) a temperatura ambiente.
  7. Disuelva el pellet en 12 μl de agua fría libre de nucleasas. PRECAUCIÓN: Todos los pasos subsiguientes deben realizarse manteniendo la muestra de cARN sobre hielo.
  8. Determine la concentración de cARN utilizando un espectrofotómetro (e.g. Eppendorf BioPhotometer).
  9. Verifique la integridad del cARN mediante electroforesis en gel de agarosa. PRECAUCIÓN: Esta verificación cruzada es necesaria, ya que incluso el ARN parcialmente degradado produce una absorción de UV distinta de cero. Para la electroforesis de cARN, utilice una cámara de electroforesis completamente limpia, recién llenada con tampón TAE y un gel de agarosa al 1% recién preparado. Si se sospecha contaminación por ribonucleasas en la cámara de electroforesis o en el tampón, llene la cámara con HCl 0,1 M durante 1 hora para su limpieza y prepare el tampón TAE con agua libre de nucleasas.
  10. Almacene el cARN a -20 °C hasta su uso. El cARN puede almacenarse durante al menos un año a -20 °C.

4. Obtención de material de ovario de hembras de Xenopus laevis mediante ovariectomía parcial

Este protocolo ha sido aprobado por la autoridad estatal responsable (Landesamt für Gesundheit und Soziales Berlin, The Senate of Berlin, Alemania).

  1. No alimente la rana al menos 12 horas antes de la cirugía para prevenir el vómito.
  2. Prepare una solución de 2 g del anestésico local tricaina (MS-222) disueltos en 1 L de agua ajustada a pH 7,0 con tampón HEPES 5 mM. PRECAUCIÓN: Use guantes de nitrilo en todo momento al manipular MS-222 y prepare la solución en una cabina de seguridad química.
  3. Sumerja la rana en la solución de tricaina (máx. 10 min) hasta que el animal ya no presente reflejos de enderezamiento. Para comprobar la falta de respuesta, intente dar vuelta a la rana boca arriba en sus manos y observe movimientos de defensa.
  4. Saque la rana de la solución de tricaina manualmente y enjuague el animal con agua del grifo fría para eliminar el anestésico.
  5. Coloque la rana con la espalda hacia arriba sobre una cama de hielo cubierta con una toalla de papel húmeda para evitar dañar la piel de la rana por contacto directo con el hielo. Mantenga la piel del animal húmeda en todo momento durante la operación para evitar que se seque. Colocarla sobre hielo prolonga el tiempo de anestesia.
  6. Realice una pequeña incisión abdominal (de 8-10 mm de longitud) con tijeras afiladas en el lado izquierdo o derecho de la línea media de la rana. PRECAUCIÓN: Tenga cuidado de no lesionar la línea lateral. Las cirugías posteriores deben realizarse en lados alternados para permitir una buena recuperación del tejido ovárico subyacente. Por lo general, deben atravesarse tres capas de tejido (la piel externa, una capa delgada de tejido conectivo blanco —la fascia— y una capa muscular).
  7. Después de abrir el abdomen, agarre partes de los lóbulos ováricos con pinzas romas y tire suavemente hacia el exterior. Como referencia, retire aproximadamente 3-5 cm de tejido ovárico del ovario mediante incisión. En caso de lesión de pequeños vasos sanguíneos y sangrado, aplique presión con una varilla de plástico estéril o enfríe la lesión con hielo hasta que cese el sangrado.
  8. Cierre quirúrgicamente la incisión utilizando un patrón de puntos separados con sutura Ethicon Vicryl 4.0 (Johnson & Johnson #V633H). Use instrumentos quirúrgicos para la sutura y anude dos o tres nudos por separado a lo largo de la incisión. PRECAUCIÓN: Es importante que cada nudo suture las tres capas de tejido en un solo paso.
  9. Después de la operación, coloque la rana en una fuente de agua ligeramente inclinada (30 L), que contenga suficiente agua para cubrir solo su fondo, de modo que las fosas nasales del animal queden por encima del nivel del agua para permitir la respiración. Cubra al animal durante el período de recuperación (aproximadamente 1-2 horas) con una toalla de papel húmeda para evitar el secado de la piel sensible.
  10. Cuando el animal vuelva a estar activo, llene la fuente de agua y mantenga a la rana separada de los demás animales durante 3-4 días para monitorear su recuperación y la cicatrización de la herida.
  11. Después de la cirugía, evite someter a la rana a operaciones posteriores durante al menos 3 meses para permitir una recuperación completa del animal y de su tejido ovárico. Como referencia, se pueden realizar un máximo de 6-8 cirugías en cada rana.

5. Aislamiento enzimático de ovocitos individuales

  1. Cortar el material ovárico en trozos más pequeños con tijeras y transferir el tejido a Solución Ringer para ovocitos sin Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂)2, 5 mM HEPES, pH 7,4) que contiene colagenasa (20 mg/ml, tipo 1A de Clostridium hystolyticum, Sigma #C9891) e inhibidor de tripsina (10 mg/ml, tipo III-O de albúmina de huevo de pollo, Sigma #T2011).
  2. Agite suavemente la solución digestiva durante 2,5 h a 18 °CPosteriormente, siga el progreso de la digestión a intervalos de 15 minutos hasta que la mayoría de los ovocitos se separen del tejido folicular.
  3. Lave los ovocitos varias veces en un tubo Falcon de 50 ml con Solución Ringer para ovocitos sin Ca2+ hasta que la solución esté suficientemente libre de restos de tejido.
  4. Almacene los ovocitos en Solución de Ringer para ovocitos que contiene Ca2+ (110 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl₂)2, 2 mM CaCl₂2, 5 mM HEPES, pH 7,4) incluyendo gentamicina (50 μg/ml) en 18 °C.

6. Inyección de ARNc

  1. Para la expresión de Na+,K+- o H+,K+-ATPasa, inyecte ovocitos con 50 nl de solución de ARNc que contenga 25 ng de ARNc de la subunidad α y 5 ng de ARNc de la subunidad β, utilizando una bomba de inyección eléctrica Nanoject II (Drummond Scientific Inc.), con tubos de hematocrito de 3.5" (Drummond #3 000-203-G/X). PRECAUCIÓN: La cantidad de ARNm puede variar según la proteína diana y podría necesitar ajustarse para lograr una expresión máxima mediante inmunotransferencia.
  2. Para cada condición de flujo (por ejemplo, a una concentración específica de Rb+), inyecte entre 18 y 22 ovocitos. De estos, el 50 % se analizará bajo condiciones "+flujo" (por ejemplo, una determinada concentración de Rb+), y el 50 % restante bajo condiciones "-flujo" (por ejemplo, con la concentración elegida de Rb+ y un inhibidor específico de la enzima en concentración saturante, como 10 mM de ouabaina para la Na+,K+-ATPasa o 10 μM de SCH28080 a pH 5.5 para la H+,K+-ATPasa).
  3. Después de la inyección, transfiera los ovocitos individualmente a placas de 96 pocillos llenas hasta la mitad con solución de Ringer para ovocitos que contenga Ca2+ y 50 μg/ml de gentamicina, a 18 °C.
  4. Cubra la placa de 96 pocillos con Parafilm para evitar una evaporación excesiva.
  5. Incube los ovocitos durante 2-7 días (según la proteína de interés) a 18 °C. Si se requiere almacenar los ovocitos por más de 3 días, se recomienda renovar el tampón de incubación dentro de los pocillos cada 3 días.
  6. Para cada conjunto de datos de flujo (por ejemplo, un experimento de titulación frente a [Rb+]), deben analizarse aproximadamente 10 ovocitos no inyectados (o inyectados con 50 nl de agua libre de nucleasas) como controles bajo condiciones "+flujo" y "-flujo". Por lo tanto, incube un número suficiente de células control de la misma manera que los ovocitos inyectados con ARNc antes del análisis de flujo.

Pretratamiento de oocitos que expresan ATPasa heteróloga

Procedimiento de carga con Na+

Para mediciones funcionales de la Na+/K+-ATPasa, es importante elevar la concentración intracelular de Na+13, como se indica a continuación:

  1. Transferir los ovocitos al Na+ Loading Buffer (110 mM NaCl, 2,5 mM Na-citrato, 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) durante 45 min en hielo.
  2. Para la recuperación posterior, incubar los ovocitos en el Post Loading Buffer "PLB" (100 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM BaCl2, 5 mM NiCl2 y 2,5 mM MOPS, 2,5 mM TRIS, pH 7,4) durante al menos 30 min en hielo.
  3. Guardar los ovocitos en PLB en hielo hasta su uso.

7. Prebloqueo de la Na+,K+-ATPasa endógena

PRECAUCIÓN: Dado que los ovocitos de Xenopus expresan una Na+,K+-ATPasa endógena, es importante bloquear esta bomba endógena antes de realizar experimentos de flujo de Rb+, de la siguiente manera:

  1. Ahora, bloquee la Na+,K+-ATPasa endógena incubando los ovocitos en tampón posterior a la carga que contiene 100 μM de ouabaina durante 15 min a temperatura ambiente.

8. Electrónica fisiológica

  1. Prepare microelectrodos tirando capilares de borosilicato (GB150F-8P, Science Products GmbH) utilizando un micropipeteador de dos pasos (Modelo PC-10, Narishige).
  2. Llene los electrodos de vidrio por la parte trasera con KCl 3 M. Para experimentos de TEVC con H+,K+-ATPasa, recomendamos usar NaCl 3 M en su lugar, lo que proporcionó grabaciones de corriente más estables. Monte la pipeta sobre el hilo de Ag/AgCl de los soportes de microelectrodos del sistema de bloqueo de voltaje de dos electrodos.
  3. Introduzca los microelectrodos de vidrio y dos puentes de agar (que deben prepararse con NaCl/agar en lugar del KCl/agar comúnmente usado), que conectan los electrodos de referencia de Ag/AgCl con la solución del baño, en la cámara de registro (Warner Instr., modelo RC-10) previamente llenada con tampón de medición (por ejemplo, PLB con ouabaína 10 μM para Na+,K+-ATPasa).
  4. Cambie el amplificador de bloqueo de voltaje (Turbo TEC-10CX, NPI Electronics, Tamm, Alemania) al modo "OFF".
  5. Verifique la resistencia de cada electrodo de vidrio por separado (ambos deben estar en el rango de 0,5-2 MΩ).
  6. Verifique los potenciales de desplazamiento del electrodo de voltaje y de corriente en la pantalla correspondiente del amplificador TEVC. En caso de desviación respecto a cero, ajuste el desplazamiento con los reguladores de desplazamiento correspondientes del amplificador.
  7. Coloque un ovocito en el centro de la cámara y penetre suavemente la membrana con el electrodo de corriente y el electrodo de voltaje.
  8. Verifique la lectura de potencial del amplificador. La lectura del potencial del electrodo de voltaje ahora proporciona el valor del potencial de reposo de la célula.
  9. Cambie el amplificador al modo VC (bloqueo de voltaje).
  10. Utilizando el software pCLAMP (Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA), fije la célula a un potencial de membrana predefinido. Este puede ser el valor del potencial de reposo medido previamente (para grabar bajo condiciones de corriente de membrana cero) o cualquier valor de potencial de prueba deseado. Preste atención a la amplitud y estabilidad de la corriente de fuga (en ausencia de K+/Rb+/Li+), que, como guía general, no debe exceder -200 nA a -30 mV.
  11. Perfunda el ovocito durante un tiempo determinado (por ejemplo, 3 min para Na+,K+-ATPasa) con una solución que contenga Rb+ (para obtener corriente máxima, use concentraciones saturantes obtenidas mediante mediciones de flujo en condiciones no bloqueadas) y registre la corriente de la bomba con el software pCLAMP en modo de grabación continua. Asegúrese de que la captación de Rb+ se detenga completamente después mediante la perfusión de la célula con una solución libre de Rb+ durante 30 segundos.
    1. Detenga el experimento de bloqueo de voltaje de dos electrodos, retire el ovocito de la cámara de registro y continúe con el paso 4 de lavado del apartado "Experimentos de captación de Rb+" para analizar la captación de Rb+ mediante espectrofotometría de absorción atómica.
  12. Realice la sustracción de la corriente de desplazamiento y evalúe la integral temporal de la corriente de la bomba utilizando el programa Clampfit del paquete pCLAMP.

9. Mediciones de la absorción de Rb+

  1. Corte y derrita la punta amarilla de una pipeta en una pipeta de 200 μl hasta un diámetro de aproximadamente 2 mm. El uso de estas puntas asegura una transferencia mínima de solución cuando los ovocitos se mueven entre placas de incubación o lavado. Derrita brevemente la punta con la llama de un encendedor de bolsillo. Este paso de pulido evita dañar los ovocitos.
  2. Prepare para cada ovocito que se va a medir un tubo Eppendorf de 1,5 ml lleno con 1 ml de agua Millipore. Organice tres placas de Petri con tampón de lavado libre de Rb+ (por ejemplo, PLB) y una con agua Millipore.
  3. Transfiera simultáneamente cinco ovocitos preincubados a una placa de Petri de 3,5 cm llena con tampón para flujo de Rb+ (concentraciones de 0 a 15 mM de Rb+) e incube durante 3 min (Na+,K+-ATPasa) o 15 min (H+,K+-ATPasa) bajo control de temperatura (por ejemplo, 21 °C en una habitación con aire acondicionado o sobre una placa calefactora).
  4. Transfiera simultáneamente los ovocitos a la primera placa con tampón de lavado libre de Rb+ (en el caso de la Na+,K+-ATPasa se puede usar PLB). Es obligatorio mantener las desviaciones entre los tiempos de incubación menores a 5 s. Enjuague suavemente.
  5. Mueva los ovocitos a la segunda y tercera placa con tampón de lavado libre de Rb+, enjuague suavemente.
  6. Transfiera los ovocitos a la placa con agua Millipore, enjuague suavemente.
  7. Transfiera cada ovocito individualmente a uno de los tubos Eppendorf preparados llenos con 1 ml de agua Millipore.
  8. Homogenice el ovocito pipeteando arriba y abajo con una punta de pipeta de 200 μl hasta que la solución esté uniformemente turbia.

10. Preparación del AAnalyst 800 utilizando el sistema de horno THGA

  1. Encienda la válvula del gas inerte requerido (argón) e inserte una lámpara de cátodo hueco adecuada (lámparas de cátodo hueco de elemento único para Li+ o Rb+; Photron, Melbourne, Australia) en una posición arbitraria del zócalo.
  2. Inicie el software de control WinLab32 (Perkin Elmer) y encienda la lámpara de cátodo hueco correspondiente. Las lámparas de cátodo hueco Perkin Elmer Lumina se reconocen automáticamente y aparecen en la lista de selección. Las lámparas de cátodo hueco no compatibles deben ingresarse manualmente.
  3. Permita un tiempo de calentamiento de aproximadamente 10-15 min para la estabilización de las lámparas.
  4. Asegúrese de que el tubo THGA (tubo de atomizador de grafito con calentamiento transversal, Perkin Elmer, #B3000641) esté en buen estado mediante inspección visual. Los hornos THGA deben reemplazarse cada 300 disparos (vida útil promedio indicada por el fabricante), aunque pueden soportar un número mayor de muestras.
  5. Seleccione la técnica de "horno THGA" en WinLab32.
  6. Prepare al menos cinco muestras de calibración con concentraciones de Rb+/Li+ entre 10 y 50 μg/L (por ejemplo, mediante dilución adecuada a partir de una solución de RbCl o LiCl 1 M) y una muestra en blanco con agua Millipore únicamente. Nota: las sales deben tener la máxima pureza disponible ("puriss." o provenientes de estándares comerciales de calibración para fines de AAS).
  7. Seleccione el archivo de inicialización adecuado (denominado archivo "método", que proporciona una referencia a los parámetros de calibración y carga la configuración del instrumento, por ejemplo, la longitud de onda de detección en AAS; las longitudes de onda para Rb+ y Li+ son 780 nm y 670.8 nm, respectivamente), luego ingrese las posiciones y concentraciones de las muestras de calibración. Para ello, seleccione el autómuestreador adecuado (bandeja de muestras con 88 o 148 posiciones de muestreo para el dispositivo AAnalyst 800).
  8. Mida la curva de calibración.
  9. Ahora transfiera cada homogenato de ovocito a vasos muestrales individuales de polipropileno de 1,2 ml (Perkin Elmer, #B0510397) y coloque estos tubos de ensayo en la bandeja del autómuestreador.
  10. Cree un archivo de información de muestras para identificar las muestras en las posiciones del autómuestreador, ajuste el volumen de muestra a 20 μl y active el instrumento.
  11. Tras finalizar el análisis (o durante la inspección visual cada hora, en series largas de muestras), revise las muestras en las que la cantidad medida de Rb+ supere el valor máximo de la curva de calibración. De ser así, diluya las muestras correspondientes adecuadamente y vuélvalas a medir.

11. Observaciones para la medición de un gran número de muestras (más de 50)

  • Para una operación nocturna del instrumento, se recomienda llenar el depósito del muestreador automático con agua Millipore para prevenir la evaporación de los homogenizados en los tubos de ensayo.
  • Se recomienda colocar entre cada 20 muestras un tubo de ensayo con HNO3 al 2% para evitar la obstrucción de la capilar de inyección del muestreador automático.

Protocolo de temperatura recomendado de THGA-AAS para rubidio

PasoTemperatura (°C)Tiempo de rampa (seg)Tiempo de retención (seg)Flujo de gas argón (ml/min)
Secado 1110120250
Secado 2130530250
Pirólisis300-6001020250
Atomización1700-1800050
Limpieza240012250

Protocolo de temperatura recomendado de THGA-AAS para litio

PasoTemperatura (°C)Tiempo de rampa (seg)Tiempo de retención (seg)Flujo de gas argón (ml/min)
Secado 1110130250
Secado 21301530250
Pirólisis9001020250
Atomización2200050
Limpieza245013250

Análisis de datos

  1. Para cada condición de medición, calcule la captación media de Rb+. El espectrofotómetro de AAS proporciona valores en μg/L, que deben convertirse a pmol/óocito/min.
  2. Para los análisis cinéticos (valores aparentes de KM), reste la captación de fondo de Rb+ determinada a partir de óocitos control no inyectados del mismo lote, a la concentración dada de RbCl.
  3. Represente gráficamente con el software Origin y aplique el ajuste de una función de Hill Fórmula de la ecuación de Hill; diagrama de cinética bioquímica; análisis de afinidad de unión; sustrato enzimático. o de Michaelis-Menten Ecuación de cinética enzimática; fórmula A = Amax[S]/(K0.5 + [S]); concepto de bioquímica. a los datos. En estas ecuaciones, [S] es la concentración de sustrato, nH el coeficiente de Hill y K0.5 la concentración de sustrato necesaria para la activación a la mitad del valor máximo.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

La cuantificación de la captación de Rb+ por ATPasas de tipo P contratransportadoras de K+ (o Rb+) mediante AAS en el sistema de expresión de ovocitos de Xenopus permite la determinación confiable de los parámetros cinéticos enzimáticos.

Determinación de la estequiometría de transporte de la Na+/K+-ATPasa

Para la Na+/K+-ATPasa electrogénica, los flujos de Rb+ pueden determi...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

El método descrito para medir la cantidad de Rb+ (o Li+) absorbida en ovocitos individuales de Xenopus que expresan Na+,K+- o H+,K+-ATPasa ha demostrado ser una técnica versátil, flexible y precisa para determinar los parámetros cinéticos o termodinámicos de transporte de ATPasas de tipo P1,4,5,7,8 que contratransportan cationes. Es una alternativa segura y confiable a los ensayos de flujo de trazadores radiactivos y permite abordar una...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores agradecen a Ernst Bamberg (Instituto Max-Planck de Biofísica, Frankfurt, Alemania) por su generoso apoyo durante la fase inicial del desarrollo del método, a Kazuhiro Abe (Universidad de Kioto, Japón) por numerosas discusiones fructíferas y al Dr. Michael Kohl (Analytik-Service, Woltersdorf, Alemania) por su apoyo técnico. Los autores agradecen la financiación de la Fundación Alemana de Investigación DFG (Cluster of Excellence "Unifying Concepts in Catalysis"), que también financió el aparato Perkin Elmer AAnalyst 800 (SFB 498).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
4.0 Ethicon Material de sutura VicrylJohnsonJohnson V633H
Colagenasa tipo 1A de Clostridium hystolyticumSigma AldrichC9891
Kit de purificación de productos de PCR de alta purezaRoche Applied Science11732676001
Agua sin nucleasasAmbionAM9937
mMessage mMachine Kit SP6/ T7Ambion1340, 1344
Ouabain octahidratoSigma AldrichO3125
Tricaína (sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato)Sigma AldrichA5040
Inhibidor de tripsina tipo III-O de clara de huevo de gallinaSigma AldrichT2011
SCH28080Sigma AldrichS4443
AAnalyst 800Perkin Elmer0993-5256
WinLab32TMPerkin Elmer
BiofotómetroEppendorf6131 000.012
Capilares de borosilicatocientíficosGB150F-8P
Tubos de hematocrito 3.5 "Drummond Scientific3 000-203-G / X
Lámpara de cátodo huecoLithium PhotronP929LL
lámpara de cátodo hueco photron de rubidioP945
extractor de micropipetas Narishigemodelo PC-10
cámara de registro de ovocitos RC-10Warner Instr.W4 64-0306
Bomba de inyección Nanoject IIDrummond Scientific3-000-204
software pCLAMPMolecular Devices
Vaso de muestra de polipropileno (1,2 ml)Perkin ElmerB0510397
Speedvac - Concentrador modelo 5301Eppendorf5301 000.210
Tubo THGAPerkin ElmerB3000641
Amplificador Turbo TEC-10CX NPIElectronicsTEC-10CX
Productos

Referencias

  1. Tavraz, N. N., et al. Impaired plasma membrane targeting or protein stability by certain ATP1A2 mutations identified in sporadic or familial hemiplegic migraine. Channels (Austin). 3, 82-87 (2009).
  2. Castillo, J. P., et al. Energy landscape of the reactions governing the Na+ deeply occluded state of the Na+/K+-ATPase in the giant axon of the Humboldt squid. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 20556-20561 (2011).
  3. Friedrich, T., Bamberg, E., Nagel, G. Na+,K+-ATPase pump currents in giant excised patches activated by an ATP concentration jump. Biophys J. 71, 2486-2500 (1996).
  4. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Dempski, R. E., Bamberg, E., Friedrich, T. Functional significance of E2 state stabilization by specific alpha/beta-subunit interactions of Na,K- and H,K-ATPase. J. Biol. Chem. 284, 3842-3854 (2009).
  5. Dürr, K. L., Abe, K., Tavraz, N. N., Friedrich, T. E2P state stabilization by the N-terminal tail of the H,K-ATPase beta-subunit is critical for efficient proton pumping under in vivo conditions. J. Biol. Chem. 284, 20147-20154 (2009).
  6. Durr, K. L., Tavraz, N. N., Zimmermann, D., Bamberg, E., Friedrich, T. Characterization of Na,K-ATPase and H,K-ATPase enzymes with glycosylation-deficient beta-subunit variants by voltage-clamp fluorometry in Xenopus oocytes. Biochemistry. 47, 4288-4297 (2008).
  7. Dürr, K. L., Tavraz, N. N., Friedrich, T. Control of gastric H,K-ATPase activity by cations, voltage and intracellular pH analyzed by voltage clamp fluorometry in Xenopus oocytes. PLoS One. 7, e33645(2012).
  8. Tavraz, N. N., et al. Diverse functional consequences of mutations in the Na+/K+-ATPase alpha2-subunit causing familial hemiplegic migraine type 2. J. Biol. Chem. 283, 31097-31106 (2008).
  9. Lorenz, C., Pusch, M., Jentsch, T. J. Heteromultimeric CLC chloride channels with novel properties. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 13362-13366 (1996).
  10. Koenderink, J. B., et al. Na,K-ATPase mutations in familial hemiplegic migraine lead to functional inactivation. Biochim. Biophys. Acta. 1669, 61-68 (2005).
  11. Price, E. M. J., Lingrel, B. Structure-function relationships in the Na,K-ATPase alpha subunit: site-directed mutagenesis of glutamine-111 to arginine and asparagine-122 to aspartic acid generates a ouabain-resistant enzyme. Biochemistry. 27, 8400-8408 (1988).
  12. Richards, R., Dempski, R. E. Examining the conformational dynamics of membrane proteins in situ with site-directed fluorescence labeling. J. Vis. Exp. (2627), e2627(2011).
  13. Lafaire, A. V., Schwarz, W. Voltage dependence of the rheogenic Na+/K+ ATPase in the membrane of oocytes of Xenopus laevis. J. Membr. Biol. 91, 43-51 (1986).
  14. Morth, J. P., Pedersen, B. P., Toustrup-Jensen, M. S., Sorensen, T. L., Petersen, J., Andersen, J. P., Vilsen, B., Nissen, P. Crystal structure of the sodium-potassium pump. Nature. 450, 1043-1049 (2007).
  15. Toustrup-Jensen, M. S., et al. The C terminus of Na+,K+-ATPase controls Na+ affinity on both sides of the membrane through Arg935. J. Biol. Chem. 284, 18715-18725 (2009).
  16. Morth, J. P., et al. The structure of the Na+,K+-ATPase and mapping of isoform differences and disease-related mutations. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 364, 217-227 (2009).
  17. Yaragatupalli, S., Olivera, J. F., Gatto, C., Artigas, P. Altered Na+ transport after an intracellular alpha-subunit deletion reveals strict external sequential release of Na+ from the Na/K pump. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 15507-15512 (2009).
  18. Meier, S., Tavraz, N. N., Durr, K. L., Friedrich, T. Hyperpolarization-activated inward leakage currents caused by deletion or mutation of carboxy-terminal tyrosines of the Na+/K+-ATPase {alpha} subunit. J. Gen. Physiol. 135, 115-134 (2010).
  19. Vedovato, N., Gadsby, D. C. The two C-terminal tyrosines stabilize occluded Na/K pump conformations containing Na or K ions. J. Gen. Physiol. 136, 63-82 (2010).
  20. Chakavarti, B., Chakavarti, D. Electrophoretic separation of proteins. J. Vis. Exp. (16), e758(2008).
  21. Kamsteeg, E. J., Deen, P. M. Importance of aquaporin-2 expression levels in genotype -phenotype studies in nephrogenic diabetes insipidus. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 279, 778-784 (2000).
  22. Koenderink, J. B., et al. Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket. J. Biol. Chem. 278, 51213-51222 (2003).
  23. Gottardi, C. J., Caplan, M. J. Molecular requirements for the cell-surface expression of multisubunit ion-transporting ATPases. Identification of protein domains that participate in Na,K-ATPase and H,K-ATPase subunit assembly. J. Biol. Chem. 268, 14342-14347 (1993).
  24. Mathews, P. M., et al. Primary structure and functional expression of the mouse and frog alpha-subunit of the gastric H+-K+-ATPase. Am. J. Physiol. 268, 1207-1214 (1995).
  25. Horisberger, J. D., et al. The H,K-ATPase beta-subunit can act as a surrogate for the beta-subunit of Na,K-pumps. J. Biol. Chem. 266, 19131-19134 (1991).
  26. Guennoun-Lehmann, S., Fonseca, J. E., Horisberger, J. D., Rakowski, R. F. Palytoxin acts on Na+,K+-ATPase but not nongastric H+,K+-ATPase. J. Membr. Biol. 216, 107-116 (2007).
  27. Horisberger, J. D., Guennoun, S., Burnay, M., Geering, K. Cation stoichiometry and cation pathway in the Na,K-ATPase and nongastric H,K-ATPase. Ann. N.Y. Acad. Sci.. 986, 127-132 (2003).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Explorar más artículos

Clamp de voltaje de dos electrodoscaptación de rubidioatomizador de grafito calentado transversalmentecontrol del potencial de membranaestequiometría del transporte
Medición de transporte de cationes por Na, K y H, K-ATPasa en
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.