Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de Caenorhabditis elegans 'Locomotion

Summary

Un método de micro-electro-fluido semi-automático para inducir la locomoción en la demanda de Caenorhabditis elegans Se describe. Este método se basa en el fenómeno neurofisiológica de gusanos que responden a los campos eléctricos suaves ("electrotaxis") dentro de los canales de microfluidos. Microfluidos electrotaxis sirve como una técnica rápida, sensible, de bajo costo, y escalable para la detección de factores que afectan a la salud neuronal.

Abstract

Los nematodo Caenorhabditis elegans es un organismo modelo para la investigación biomédica versátil debido a su conservación de los genes y las vías relacionadas con la enfermedad, así como su facilidad de cultivo. Varios C. modelos de enfermedad elegans han sido reportados, incluyendo trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Parkinson (EP), que implica la degeneración de dopaminérgico (DA), las neuronas ^1. Tanto los transgenes y los productos químicos neurotóxicos se han utilizado para inducir la neurodegeneración DA y defectos movimiento consiguientes en gusanos, lo que permite las investigaciones sobre la base de la neurodegeneración y las pantallas de los genes neuroprotectores y compuestos ^2,3.

Pantallas en eucariotas inferiores como C. elegans proporcionan un medio eficiente y económico para identificar compuestos y genes que afectan a la señalización neuronal. Pantallas convencionales se realizan típicamente de forma manual y marcados por inspección visual y, en consecuencia, son el tiempo-contrasUming y propenso a errores humanos. Además, la mayoría se centran en el análisis de nivel celular, mientras que haciendo caso omiso de la locomoción, que es un parámetro especialmente importante para los trastornos del movimiento.

Hemos desarrollado un nuevo sistema de selección de microfluidos (Figura 1) que controla y cuantifica C. locomoción elegans 'utilizando estímulos de campo eléctrico en el interior de microcanales. Hemos demostrado que un campo de corriente continua (CC) puede inducir robustamente en-demanda locomoción hacia el cátodo ("electrotaxis") ^4. Invertir la polaridad del campo hace que el tornillo sin fin de revertir rápidamente su dirección. También hemos demostrado que los defectos en las neuronas sensoriales y dopaminérgicas otra alteran la respuesta de natación ^5. Por lo tanto, las anormalidades en la señalización neuronal se puede determinar utilizando la locomoción como una lectura de salida. La respuesta del movimiento se puede cuantificar con precisión mediante una serie de parámetros tales como la velocidad de natación, frecuencia de flexión cuerpo y el tiempo de reversión.

4. Estos hallazgos llevaron a diseñar un nuevo dispositivo de microfluidos para ordenar pasivamente gusanos por la edad y el fenotipo ^6.

También hemos puesto a prueba la respuesta de los gusanos a impulsos DC y alterna los campos eléctricos de corriente (AC). Campos de CC pulsada de diversos ciclos de trabajo efectivamente electrotaxis generados en tanto C. elegans y su primo C. briggsae ^7. En otro experimento, los campos de CA simétricas con frecuencias que van desde 1 Hz a 3 KHz inmovilizados gusanos en el interior del canal ^8.

Aplicación del campo eléctrico en un entorno microfluídico permite una ejecución rápida y automatizada del ensayo electrotaxis. Este enfoque promete para facilitar pantallas genéticas y químicas de alto rendimiento para los factoresque afecta a la función neuronal y la viabilidad.

Protocol

1. La fotolitografía de fabricación Molde Maestro

1. Bañar una oblea de silicio de 3 pulgadas en acetona durante 30 segundos y después metanol durante 30 segundos. Enjuague con dH ₂ 0 agua durante 5 minutos.
2. Seque la superficie de la oblea con una pistola de aire comprimido N2. Se calienta la oblea en una placa caliente a 140 ° C durante 2 min.
3. Plasma oxidar la superficie de la oblea de silicio (1 min, 50 W).
4. Spin-capa de la superficie de la oblea con 3 ml SU-8 100 fotosensible (40 seg; 1.750 rpm).
5. Pre-hornear la oblea recubierta sobre una placa caliente a 65 ° C durante 10 min, a continuación, la rampa la temperatura hasta 95 ° C durante 2 min. Mantener esta configuración durante 1 h adicional.
6. Alinear una fotomáscara con el diseño de canal deseado. Exponer al resistirse a 550-600 mJ / cm ² de la luz UV (350-400 nm). Photomasks se pueden diseñar en AutoCAD y se imprimen en una transparencia con la impresión de alta resolución.
7. Post-hornear la oblea en una placa caliente a 65 ° C durante 1 min y 95 ° C durante 10 min, el aumento gradual de tque la temperatura que antes.
8. Sumerja la oblea de SU-8 solución de revelado durante 10-15 min. Compruebe la finalización del desarrollo de un enjuague con isopropanol. Si aparece un precipitado blanco, continuar con el desarrollo. El molde maestro se muestra en la Figura 2A.

2. Litografía blanda para Fabricación Microchannel

1. Mezclar 35 ml de polidimetilsiloxano (PDMS) con base de elastómero de 3,5 ml de agente de curado PDMS.
2. Coloque el molde maestro fabricada (patrón hacia arriba) y una oblea de silicio en blanco en placas de Petri llenas de papel de aluminio.
3. Verter 20 ml PDMS prepolímero en el plato de molde maestro y 15 ml en el segundo plato. Eliminar las burbujas de aire debajo de las obleas presionando suavemente con un aplicador de madera desechable.
4. Cubra ambos platos y dejar de lado por un día para curar. Alternativamente, para el curado más rápido, eliminar las burbujas de aire de la PDMS con un desgasificador de vacío y luego dejar los platos en una placa caliente a 80 ° C durante 2hora
5. Quite el papel de aluminio y la cáscara de la PDMS de las obleas.
6. Utilice la Harris Uni-Core (2,5 mm) para perforar los puertos de acceso de fluidos en ambos extremos del canal. Cortar el canal y en blanco PDMS en tiras de tamaño similar.
7. Cargar el canal, la tira de PDMS en blanco y un portaobjetos de vidrio (75 × 25 mm ²⁾ en un plasma oxidante, probablemente situado en una sala limpia. Exponer al plasma de oxígeno durante 40 segundos a potencia 40 W.
8. Pegar la pieza del canal y portaobjetos de vidrio a los lados opuestos de la tira en blanco. Ponga a un lado durante 2 horas para completar la unión.
9. Coloque el conjunto sobre una placa caliente a 120 ° C. Conecte el tubo de plástico (diámetro interior de 1/32 ", diámetro exterior de 3/32"), cada uno por lo menos 6 pulgadas de largo, a los depósitos perforados utilizando PDMS prepolímero. Fije un conector de plástico fluídico a uno o ambos tubos para permitir la fijación jeringa, o utilizar accesorios disponibles comercialmente.
10. Permitir el PDMS asegurar el tubo para curar. Inserte 3 "longitudes de calibre 22 alambre de cobre aislado en each depósito, entre el tubo de entrada y el canal, y seguro con PDMS prepolímero. El producto terminado se muestra en la Figura 2B.

3. Electrotaxis Experiment

1. Coloque el microcanal en la etapa (preferiblemente XY-móvil) de un microscopio con una cámara montada conectado a un monitor (Figura 1).
2. Conecte la fuente de alimentación o cables de salida del amplificador a los electrodos del microcanal. Una fuente de alimentación de CC simple es suficiente si sólo se desea una señal de CC, pero un amplificador conectado a un generador de funciones permite la aplicación de señales de CA y CC pulsada así.
3. Fije el tubo de salida del microcanal a una jeringa desechable. Sumergir la boca del tubo de entrada en tampón fisiológico M9 y suavemente aspiran líquido en el canal mediante la aplicación de una presión negativa dentro de la jeringa (ya sea manualmente o usando una bomba de jeringa). Cuando los tubos de entrada y de salida son a la vez lleno de M9, desconecte la jeringa fROM del tubo. Nivel ambos tubos a la misma altura para evitar el flujo accionado hidrostáticamente.
4. Aplicar un voltaje de CC para el canal y garantizar que la resistencia (R = V / I) es de alrededor de 0,6 mW (para una 50 mm de largo, 0,3 mm de ancho y 0,1 mm ~ microcanal profundo).
5. Si está satisfecho con la integridad de la cadena, siga los pasos anteriores para cargar los gusanos de una suspensión diluida en el canal.
6. Desconecte la jeringa y hidrostáticamente manipular el flujo mediante el ajuste de altura relativa de los tubos. Utilice este método para colocar un tornillo sin fin en el centro del canal y a continuación, establecer ambos tubos plana a la misma elevación.
7. Establecer la fuente de alimentación a la tensión apropiada: 4-12 V / cm para L3 animales etapa, 4-10 V / cm para L4s, y 2-4 V / cm para los adultos jóvenes. Active la señal eléctrica y deje 1 min de pre-exposición para el gusano para aclimatarse al campo. El gusano debería comenzar a moverse hacia el cátodo. Cuando el momento ha pasado, usar la cámara para comenzar a grabar.
8. Para CA y pulsod experimentos DC, el campo eléctrico máximo de respuesta puede ser adoptado de ciclo de la señal anterior y la frecuencia y actividad puede ser modulada deseada como ^{7, 8.}
9. Una vez finalizada experimento, eliminar todo el líquido (y gusanos) de la canal, enjuagarlo con dH ₂ 0, y dejar el dispositivo en una placa caliente a 125 ° C para secar.
10. Extraer datos de locomoción de los vídeos grabados utilizando manualmente NIH ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ ) o software de seguimiento del gusano MATLAB basado personalizado.

Results

Un representante de vídeo electrotaxis una de tipo salvaje joven de nematodos adultos y su posición y salidas de velocidad desde el software de seguimiento de gusano se muestran en la complementaria de vídeo 1 y la Figura 3. El software de análisis de movimiento en sí mismo no reconoce la dirección de la polaridad de campo y el momento de la inversión de la polaridad; más bien, esta información se debe obtener de la fuente de vídeo. Esto se podría hacer utilizando una señal de audio o v...

Discussion

Aprovechando el fenómeno de comportamiento descrito por primera vez por Gabel y sus colegas y basándose en el trabajo de manipulación dielectroforética de Chuang et al ^11,12, nuestro ensayo electrotaxis microfluidos basada en un método sencillo, robusto y sensible para investigar la actividad neuronal en los gusanos que utilizan el movimiento como una salida. El análisis de los parámetros de movimiento permite la comparación cuantitativa entre diferentes genotipos. La precisión de la fabricación de microcanal...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acetona	CALEDON Labs	1200-1-30
Metanol	CALEDON Labs	6700-1-30
Isopropanol	CALEDON Labs	8600-1-40
SU-8	Microchem Corp.	Y131273	SU-8 100
SU-8 Desarrollador	Microchem Corp.
Placa de Petri de 92x16mm	Sarstedt	82.1473.001
Sylgard 184 Kit de Elastómero de Silicona	Dow Corning		Contiene base de elastómero y agente de curado
Generador de funciones	Tektronix Inc.		Modelo AFG3022B
Amplificador	Trek Inc.		Modelo 2210-CE Bomba de
jeringa	Harvard Apparatus	70-4506	Modelo 11 ELITE
Placa calefactora	Fisher Scientific	11675916Q	Modelo HP131725Q