Method Article

Electrotaxis microfluidos basados ​​en On-Demand Análisis cuantitativo de Caenorhabditis elegans 'Locomotion

DOI:

10.3791/50226

May 2nd, 2013

In This Article

Summary

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Un método de micro-electro-fluido semi-automático para inducir la locomoción en la demanda de Caenorhabditis elegans Se describe. Este método se basa en el fenómeno neurofisiológica de gusanos que responden a los campos eléctricos suaves ("electrotaxis") dentro de los canales de microfluidos. Microfluidos electrotaxis sirve como una técnica rápida, sensible, de bajo costo, y escalable para la detección de factores que afectan a la salud neuronal.

Abstract

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Los nematodo Caenorhabditis elegans es un organismo modelo para la investigación biomédica versátil debido a su conservación de los genes y las vías relacionadas con la enfermedad, así como su facilidad de cultivo. Varios C. modelos de enfermedad elegans han sido reportados, incluyendo trastornos neurodegenerativos tales como la enfermedad de Parkinson (EP), que implica la degeneración de dopaminérgico (DA), las neuronas 1. Tanto los transgenes y los productos químicos neurotóxicos se han utilizado para inducir la neurodegeneración DA y defectos movimiento consiguientes en gusanos, lo que permite las investigaciones sobre la base de la neurodegeneración y las pantallas de los genes neuroprotectores y compuestos 2,3.

Pantallas en eucariotas inferiores como C. elegans proporcionan un medio eficiente y económico para identificar compuestos y genes que afectan a la señalización neuronal. Pantallas convencionales se realizan típicamente de forma manual y marcados por inspección visual y, en consecuencia, son el tiempo-contrasUming y propenso a errores humanos. Además, la mayoría se centran en el análisis de nivel celular, mientras que haciendo caso omiso de la locomoción, que es un parámetro especialmente importante para los trastornos del movimiento.

Hemos desarrollado un nuevo sistema de selección de microfluidos (Figura 1) que controla y cuantifica C. locomoción elegans 'utilizando estímulos de campo eléctrico en el interior de microcanales. Hemos demostrado que un campo de corriente continua (CC) puede inducir robustamente en-demanda locomoción hacia el cátodo ("electrotaxis") 4. Invertir la polaridad del campo hace que el tornillo sin fin de revertir rápidamente su dirección. También hemos demostrado que los defectos en las neuronas sensoriales y dopaminérgicas otra alteran la respuesta de natación 5. Por lo tanto, las anormalidades en la señalización neuronal se puede determinar utilizando la locomoción como una lectura de salida. La respuesta del movimiento se puede cuantificar con precisión mediante una serie de parámetros tales como la velocidad de natación, frecuencia de flexión cuerpo y el tiempo de reversión.

4. Estos hallazgos llevaron a diseñar un nuevo dispositivo de microfluidos para ordenar pasivamente gusanos por la edad y el fenotipo 6.

También hemos puesto a prueba la respuesta de los gusanos a impulsos DC y alterna los campos eléctricos de corriente (AC). Campos de CC pulsada de diversos ciclos de trabajo efectivamente electrotaxis generados en tanto C. elegans y su primo C. briggsae 7. En otro experimento, los campos de CA simétricas con frecuencias que van desde 1 Hz a 3 KHz inmovilizados gusanos en el interior del canal 8.

Aplicación del campo eléctrico en un entorno microfluídico permite una ejecución rápida y automatizada del ensayo electrotaxis. Este enfoque promete para facilitar pantallas genéticas y químicas de alto rendimiento para los factoresque afecta a la función neuronal y la viabilidad.

Protocol

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1. La fotolitografía de fabricación Molde Maestro

  1. Bañar una oblea de silicio de 3 pulgadas en acetona durante 30 segundos y después metanol durante 30 segundos. Enjuague con dH 2 0 agua durante 5 minutos.
  2. Seque la superficie de la oblea con una pistola de aire comprimido N2. Se calienta la oblea en una placa caliente a 140 ° C durante 2 min.
  3. Plasma oxidar la superficie de la oblea de silicio (1 min, 50 W).
  4. Spin-capa de la superficie de la oblea con 3 ml SU-8 100 fotosensible (40 seg; 1.750 rpm).
  5. Pre-hornear la oblea recubierta sobre una placa caliente a 65 ° C durante 10 min, a continuación, la rampa la te....

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Results

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Un representante de vídeo electrotaxis una de tipo salvaje joven de nematodos adultos y su posición y salidas de velocidad desde el software de seguimiento de gusano se muestran en la complementaria de vídeo 1 y la Figura 3. El software de análisis de movimiento en sí mismo no reconoce la dirección de la polaridad de campo y el momento de la inversión de la polaridad; más bien, esta información se debe obtener de la fuente de vídeo. Esto se podría hacer utilizando una señal de audio o v.......

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Discussion

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Aprovechando el fenómeno de comportamiento descrito por primera vez por Gabel y sus colegas y basándose en el trabajo de manipulación dielectroforética de Chuang et al 11,12, nuestro ensayo electrotaxis microfluidos basada en un método sencillo, robusto y sensible para investigar la actividad neuronal en los gusanos que utilizan el movimiento como una salida. El análisis de los parámetros de movimiento permite la comparación cuantitativa entre diferentes genotipos. La precisión de la fabricación de microcanal.......

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Disclosures

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El ensayo de la tecnología de microfluidos electrotaxis ha sido presentada por patente en los Estados Unidos de América y Canadá.

Acknowledgements

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Los autores desean agradecer a las Ciencias Naturales e Ingeniería del Consejo de Investigación de Canadá, Canadá Programa de Cátedras de Investigación, Institutos Canadienses de Investigación en Salud y Ontario Ministerio de Investigación e Innovación a través de su Programa de Premios investigadores temprana de apoyo financiero.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonaCALEDON Labs1200-1-30
MetanolCALEDON Labs6700-1-30
IsopropanolCALEDON Labs8600-1-40
SU-8Microchem Corp.Y131273SU-8 100
SU-8 DesarrolladorMicrochem Corp.
Placa de Petri de 92x16mmSarstedt82.1473.001
Sylgard 184 Kit de Elastómero de SiliconaDow CorningContiene base de elastómero y agente de curado
Generador de funcionesTektronix Inc.Modelo AFG3022B
AmplificadorTrek Inc.Modelo 2210-CE Bomba de
jeringaHarvard Apparatus70-4506Modelo 11 ELITE
Placa calefactoraFisher Scientific11675916QModelo HP131725Q
Y020100

References

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  1. Kuwahara, T., Koyama, A., et al. Familial Parkinson mutant α-synuclein causes dopamine neuron dysfunction in transgenic Caenorhabditis elegans. J. Biol. Chem. 281 (1), 334-340 (2006).
  2. Kuwahara, T., Koyama, A., et al.

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Microfluidic ElectrotaxisC Elegans LocomotionElectric Field StimulationMicrochannel DesignPDMS MoldingWorm Tracking SoftwareSwimming Speed AnalysisBody Bend FrequencyReversal Time MeasurementNeurodegenerative Disorder Screening

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