Ensayo Preferencia luz para estudiar innata y circadiano Photobehavior Regulado de Drosophila Las larvas

Aquí se describe un ensayo de comportamiento basado en la preferencia larval para la oscuridad (o luz). Las larvas se reacciona con una respuesta fotonegativa fuerte y estereotipado durante las etapas de alimentación (L1 a L3 temprana) ^1. El ensayo está destinado a evaluar el comportamiento fotofóbico de la larva y compara la preferencia claro u oscuro de un grupo de larvas mover libremente en una placa de Petri recubiertas con agar. Este ensayo de comportamiento no sólo proporciona información sobre la sensibilidad, la integración y temporal plasticidad del sistema visual, que proporciona más pistas sobre cómo sensibilidad a la luz y su proceso es controlado por el sistema circadiano.

La larva de Drosophila ojo (también llamado órgano Bowlig; BO), es el principal órgano de percepción de la luz. Cada ojo se compone de 12 fotorreceptores (PR), ocho RP expresan la sensible al verde rhodopsin6 (RH6) y cuatro rupias expresan la sensible al azul rhodopsin5 (RH5) ^2,3. Además de los RP del also clase IV neuronas multidendritic, que cubren la pared del cuerpo, las larvas se han identificado para responder a las intensidades de luz nocivos ^4,5. También se sabe que las neuronas marcapasos situadas en el cerebro de larvas centro expresan la proteína sensible a la luz Cryptochrome (Cry) que actúa como sensor de luz azul intrínseca del reloj dentro del cerebro ^6,7. Curiosamente photophobicity de animales de tipo salvaje se muestra un componente circadiano en diferentes puntos temporales durante el transcurso del día y de la noche cuando se prueba con este ensayo. Las respuestas a la luz de forrajeo larva L3 mostraron photophobicity fuerte al amanecer y al menor photophobicity al atardecer en las pruebas de preferencia de luz-oscuridad ^7. Curiosamente sólo se requieren Th5-RP para evitar la luz, mientras Rh6-RP son prescindibles. Ambos, Th5-RP y Rh6-RP están involucrados en el restablecimiento del reloj molecular por la luz ^8. La vía Cry debe coordinarse con las otras vías sensibles a la luz para organizar una salida de comportamiento apropiado en eltranscurso del día. La acetilcolina en RP juega un papel esencial en la conducta de evitación luz, así como el arrastre del reloj molecular. El bloqueo de la neurotransmisión acetilcolina de RP para las neuronas marcapasos circadiano reduce la respuesta fotofóbico en el ensayo de preferencia a la luz la oscuridad ^8. Empleando el mismo ensayo, dos pares simétricos de neuronas se han identificado recientemente para cambiar la preferencia la luz del tercer estadio larval de Drosophila ^9. Estos dos pares de neuronas pueden estar funcionando durante las etapas finales de las larvas, cuando los animales dejan la comida para encontrar presumiblemente un sitio pupariation apropiada. Sin embargo, la cuestión de cómo las vías visuales interactuar y controlar el comportamiento visual de las larvas de manera circadiana permanece en gran medida sin respuesta. El ensayo de preferencia la luz permite hacer comparaciones entre los puntos de tiempo circadiano, vuelan las líneas y estatales circadiano en diferentes calidades de luz. El ensayo es fácil de preparar y de bajo costo y ha sido de utilidad previamente in varios laboratorios para describir y estudiar el comportamiento de la luz procedente de la larva.

1. Cría de larvas

1. Mantenga volar cepas o cruces genéticos en la cultura de masas a 25 ° C en medio de harina de maíz bajo un 12 hr luz-ciclo de 12 horas de oscuridad en un fly Incubadora equipada con luz y temporizador.
2. Diluir el respaldo de la levadura en agua para formar una pasta fluida (10 g de levadura respaldo diluido con 3-4 ml destilada H ₂ O). Añadir una gota de la comida de harina de maíz y cubrir los viales. Deje secar durante al menos una hora para evitar las moscas adultas se pegue a la pasta de levadura. Poner una pequeña gota de levadura diluido en agua en la superficie de la comida puede mejorar la oviposición. Alternativamente panadero pasta de levadura, ácido acético al 20% (AcOH) (Sigma Aldrich, Suiza A6283-100 ML) se puede utilizar. Para esto, moje la punta de un Q-tip en la solución y se extendió sobre la superficie del alimento harina de maíz.
3. Ponga moscas adultas (por lo menos cuatro días de edad, pero no más de diez días) en viales de maíz alimento comida. Ponga suficientes adultos en cada vial con el fin de obtener larvas suficiente para repetir la preferenciaprobar varias veces y permitir la comparación estadística. Para cruces genéticos, por lo general utilizamos un mínimo de 20 hembras y 10.5 hombres por cada vial, pero algunas líneas necesitamos más mujeres para obtener una progenie larval suficiente.
4. Permitir que los adultos a poner huevos durante 12 horas y transferirlos a nuevos viales. Los adultos pueden ser transferidos por la mañana y la noche. Por lo general, transferimos los adultos de siete a diez días, y si es necesario tomar nuevas adultos.
5. Mantener las colecciones de huevo se toma cada 12 horas en la incubadora y hacer crecer las larvas a los 25 ° C, el ciclo de luz-oscuridad-12-hr 12-hr y 60% de humedad. Para la prueba de componentes circadianos de comportamiento visual larvas se mueven a la oscuridad constante (DD) 48 horas después de la recolección de huevos (que corresponden a dos ciclos de luz-oscuridad). Para ello, utilice una incubadora separada sin luz, pero mantener el resto de condiciones tales como la temperatura y humedad idénticas. Asegúrese de transferir los viales a la DD incubadora justo antes del cambio a la fase oscura. Antes de trasladar los frascos a Another incubadora puso los frascos en una caja de cartón o envolver los frascos con papel de aluminio para evitar la exposición a la luz durante el traslado (el embalaje en caja de cartón o embalaje tiene que ser hecho durante la "luz-en fase de" antes del cambio entre las incubadoras). Evitar que los animales de cualquier exposición a la luz después de este punto y hasta el inicio de los experimentos.
6. Después de 4 días (84 a 108 horas de la puesta de huevos) recoger temprano L3 (larvas de alimentación) en los puntos de tiempo a ensayar (ver 4. Prueba de preferencia de la Luz, punto. 4.4.).

2. Configuración de la prueba

1. Lleve a cabo experimentos en una habitación oscura con una temperatura y humedad constantes.
2. Para mantener dos cuadrantes de la placa de Petri en la oscuridad, cubra la tapa con cinta negro y papel de aluminio. Con el fin de hacerlo, marcar el centro de la circunferencia de la tapa. También marcar cuatro puntos en el borde de la tapa con 90 ° de separación entre ellos. Para hacerlo más fácil, dibuja un cuadrado de 20 cm dividido en cuatro cuadrantes de 10 cm de longitud en unhoja de papel o con la ayuda de un ordenador. Cortar 10 cm cuadrados de papel de aluminio y cinta negro (Figura 1A). Cubrimos dos cuadrantes opuestos pegando un cuadrado de papel de aluminio, como primera capa y cinta negro que lo cubre, tenga cuidado de cubrir también el borde de la tapa.
   En el pasado se utilizaron dos formas ligeramente diferentes de ensayos de este. Estamos aquí utilizamos el ensayo "cuarto de plato", en la que la placa de Petri se divide en cuatro partes iguales ^10. En el ensayo alternativo "half-plate" la placa de Petri se divide la mitad (la mitad expuesta a la luz, medio a oscuras) ^1,7,8. Hasta hoy se ha publicado ninguna diferencia significativa entre los dos ensayos.
3. Pegamento una hoja de cuadrante, como la utilizada para el marcado de las tapas justo debajo de la fuente de luz sobre la mesa. Marque la circunferencia de una placa de Petri centrado en la intersección cuadrantes. Use las marcas como referencia para colocar la placa de la prueba siempre en la misma posición bajo la fuente de luz.
4. Instale unalámpara, ya sea una bombilla de luz blanca simple (Phillips, Softtone 5W) o una lámpara de LED (lámpara de LED, 80012 Blanco, Osram) por encima de la placa de Petri con la ayuda de un soporte de apoyo de hierro (Fisher Scientific, S47808). Ajustar la altura de una manera que la placa de prueba entera se ilumina homogéneamente. Recomendamos el uso de lámparas LED, ya que emiten longitudes de onda más específicas que las bombillas convencionales. Además LED emiten menos calor.
5. Ajuste la intensidad de la luz con la ayuda de un fotómetro (medidor PCE Ambiente EM882). Para lograr la intensidad de luz requerida de 350 a 760 lux, mueve la lámpara hacia arriba o hacia abajo según sea necesario. Al conectar la lámpara a una fuente de alimentación ajustable proporciona mayor flexibilidad para cambiar la intensidad sin mover la lámpara (Figura 1B).

3. Platos Preparación

1. Hacer 200 ml de 2,5% de agar (Sigma-Aldrich, Suiza A5093-500G) con agua doble destilada (Millipore).
2. Coloque placas de Petri en una mesa (90 mm de diámetro;Greiner Bio-One GmbH, 4550 Kremsmeinster, Austria) en hileras para permitir verter caliente agarosa.
3. Hervir la agarosa en un horno de microondas hasta que la solución es completamente transparente y fluida. Asegúrese de que la solución de líquido no contiene burbujas. PRECAUCIÓN: Transporte con cuidado a la mesa ya que la solución puede ser muy caliente!
4. Verter caliente de agarosa en las placas de Petri hasta que toda la superficie está cubierto homogéneamente con una capa delgada de la solución, aproximadamente dos o tres milímetros son suficientes. Ser rápido para evitar agarosa solidifica antes de recubrir todas las placas. Deje que los platos se enfríen. Almacenar las placas a temperatura ambiente y el uso de ellos sólo en el mismo día de la preparación.

4. Prueba de Preferencia Luz

1. El trabajo en condiciones de luz roja en la sala de ensayo para evitar influencia de la luz antes de la prueba, ya Drosophila no es capaz de detectar longitudes de onda de luz roja. Utilice una bombilla de luz roja (Phillips, PFE712E * 8) montado en una lámpara para iluminar tque ponga a trabajar.
2. Mantenga la temperatura a través de todos los experimentos a 25 ° C. Control de temperatura ambiente por medio de un dispositivo de calefacción o de refrigeración si se requiere.
3. Tome un poco de comida de los viales criado durante ciclos de dos días bajo constante oscuridad (de la sección 1). Dado que las larvas son generalmente cavando en la superficie de la comida, tomar la capa superior (alrededor de 5 mm de profundidad) con ayuda de una espátula (Fisher Scientific, 14 de-373-25A). Extender la comida en el lado exterior de un plato de Petri tapa, añadir un poco de agua y mezclar suavemente con la espátula.
4. Recoger la alimentación de larvas L3 de la comida. Como se pondrá a prueba la preferencia la luz, elegir sólo a principios / alimentación de las larvas L3 es crucial ya que el phototaxis negativo está asegurada. Tarde / vagando larvas L3 o grande larva arrastrándose sobre la comida supuestamente ya cambiaron su photobehavior. La alimentación de las larvas L3 (fototácticas negativa) puede ser reconocido por sus espiráculos anteriores son abiertas y salían al exterior en forma de dedo. El espiráculo posteriors tienen tres aberturas cada una, y cuatro grupos de grandes pelos ramificados. Las glándulas salivales se extienden hasta el segundo segmento abdominal ^11. Puesta en escena larva bajo un microscopio es conveniente mientras que no la luz blanca se debe utilizar. Una lámpara de luz roja es necesario iluminar las larvas si estadificación bajo microscopio estereoscópico se requiere antes de los experimentos.
5. Lávese las larvas brevemente en agua del grifo y recoger principios de amamantar larvas de tercer estadio (aún en luz roja). Antes de transferir las larvas a la placa de la prueba, tome las larvas con una brocha húmeda y absorba con cuidado el exceso de agua con una toalla de papel o papel de filtro. No seque larvas demasiado excesivamente ya que podría dañar el animal e influir en su comportamiento.
6. Utilizando el pincel mojado transferir cuidadosamente las larvas a las placas. Colocar un grupo de aproximadamente 30 larvas en el centro de la placa. Cubrir la placa con la tapa ya se prepara con los cuadrantes y fijar la placa bajo la fuente de luz de preparado para el experimento (véase la secciónción 2).
7. Encienda la lámpara de luz blanca e iniciar el temporizador. Deje que la larva se mueve libremente en la placa durante 5 min, a continuación, eliminar rápidamente la tapa y contar el número de larvas en la oscuridad y en los cuadrantes de luz. Marcar la posición de cada larva con un marcador puede facilitar el conteo. Alternativamente tomar una imagen de la placa y contar a posteriori. Las larvas que muestran preferencia la luz clara, como larvas arrastrándose en las paredes o excavando en agar debe ser considerado como preferencia neutro y sólo se incluye en el número total de larvas cuando se calcula el índice de preferencia de la luz.
8. Después de contar, deseche la placa con larvas y sustituirla por una nueva placa de ensayo para el siguiente experimento. Recoger las placas utilizadas en una bolsa de plástico autoclave para la manipulación y eliminación posterior.
9. Una vez que haya realizado un número suficiente de experimentos de un nuevo genotipo puede ser probada. 10-15 ensayos por genotipo son suficientes para el análisis.

5. Analysi Datas

1. Para mayor comodidad transferir los datos a una hoja de datos como Excel (Microsoft) o de origen (Lab Origen) en un ordenador para su posterior análisis estadístico. Disponer en una columna el número de animales en la oscuridad, en una segunda columna el número de animales en los cuadrantes de luz y en el tercio del total de los animales en la placa (incluyendo larvas "neutro").
2. Calcular el índice de preferencia (PREF) para la oscuridad para cada experimento usando la siguiente fórmula:
   PREF (oscuridad) = (número de larvas en la oscuridad - número de larvas en la luz) / número total de larvas
3. Comparar estadísticamente un conjunto de datos con un análisis adecuado para grupos. Aquí, utilizamos una prueba de Wilcoxon para comparar estadísticamente dos grupos. Una prueba de ANOVA con-comparación múltiple de Tukey post hoc de prueba se puede hacer, si supuesto de distribución normal se cumple en un grupo de comparación múltiple.
4. Hacer gráficos que muestran claramente las comparaciones entre líneas y puntos temporales a lo largo del ciclo de día. We Software origen uso (Lab Origen) para probar la significación estadística y generar gráficos adecuados, pero cualquier otro software de estadística puede ser útil.

Siguiendo el protocolo descrito anteriormente, hemos probado la preferencia de luz-oscuridad a principios del tercer estadio larval de tipo salvaje Canton-S vuela en dos tiempos circadianos diferentes CT0 y CT12. Los adultos fueron criados de 12 horas de luz-oscuridad de 12 horas y se fueron a poner huevos durante 12 horas. Las larvas crecen los dos primeros días bajo el mismo régimen de luz-oscuridad. Ya que queríamos probar la modulación circadiana en condiciones constantes (funcionamiento libre del reloj circadiano), las larvas se transfirieron a oscuridad constante durante los próximos tres días, hasta que se realizó la prueba (Figura 3).

Aquí, se utilizó 350 lux ya que se ha demostrado que esta es la intensidad de la luz óptima para detectar diferencias de respuesta a la luz de la larva de Drosophila a lo largo del ciclo circadiano en comparación con otras intensidades (70 y 600 lux) 7. Las diferencias en la sensibilidad a la luz, y por lo tanto, en respuesta a la luz se observa al comparar CT0 con CT12. En Drosophila, CT0 coincidens con el amanecer, el ciclo medio entre CT0-CT12 es considerado el día subjetivo y del CT12 a CT24 la noche subjetiva 12. Fotosensibilidad luz es mayor brevemente después de la transición de la oscuridad a la luz, cuando casi el 77% de las larvas prefieren la oscuridad en comparación con casi el 69% de preferencia oscuro en la noche subjetiva temprana (Figura 3B). Esto también se refleja en el índice de preferencia oscuro (PREF (oscuridad)) calculado con la fórmula presentada anteriormente para cada experimento. Promediando todas las repeticiones se obtuvo un índice de preferencia de 0,52 a CT0 y de 0,36 para CT12. Utilizando la prueba de Wilcoxon (Origen) una diferencia estadística significativa entre los dos puntos de tiempo se muestra (p = 0,0229).

Figura 1. (A) Marcado cuadrantes de Petri tapas de los recipientes. Cuadrantes se pueden marcar en el plato de Petri tapa con la ayuda de un cuadrante impreso utilizado como lienzo. Posteriormente la primera capa de papel de aluminio se puede pegar en la superficie externa de la placa y se cubrió con cinta negro en los dos cuadrantes opuestos de la oscuridad. (B) Esquema configurado para la prueba de preferencia de luz-oscuridad. (C) Un Petri plato cubierto con cuadrantes oscuros y llenos de 2,5% de agar, listo para ser utilizado para los experimentos. Haz clic aquí para ver más grande la figura .

Figura 2. Prueba de preferencia de luz-oscuridad, ejemplo de un plato de la derecha después de establecer larva en la placa de ensayo (Start) y después de 5 min (End). Normalmente, se utiliza un grupo de 30 animales para cada experimento.

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Figura 3. (A) régimen de luz seguido para probar preferencia la luz en la alimentación de larvas L3. (B) Porcentaje de preferencia oscuridad durante tanto tiempo puntos sometidos a ensayo (CT0 y CT12). Porcentaje de larva que la oscuridad y la luz preferido se cuentan para cada repetición y el promedio de todas las repeticiones. Las larvas en los bordes de la placa o excavación en el agar se considera neutral. (C) índice de preferencia oscuro calculado para los mismos momentos. Diferencia estadística significativa entre los grupos se muestra por la prueba de suma de rangos de Wilcoxon (p <0,05). (N = 18 (540 larvas) por punto de tiempo). Haga clic aquí para ver más grande la figura .

Los autores no tienen nada que revelar.