Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

Michelle R. Allen-Sharpley; Michelle Tjia; Karina S. Cramer

doi:10.3791/50305

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Artículo de método

Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias

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DOI:

10.3791/50305

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18 de marzo de 2013

Michelle R. Allen-Sharpley¹ , Michelle Tjia¹ , Karina S. Cramer¹

¹Department of Neurobiology and Behavior, University of California, Irvine

En este artículo

Resumen

Aquí describimos una técnica de microdisección seguida de la inyección de tinte fluorescente en el ganglio de la acústica de los primeros embriones de pollo para el seguimiento selectivo de las fibras auditivas axones en el nervio y cerebro posterior.

Resumen

El embrión de pollo es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de las proyecciones de células ganglionares centrales y periféricas. En el sistema auditivo, el etiquetado selectivo de los axones en el nervio auditivo craneal VIII aumentaría el estudio del desarrollo central de circuito auditivo. Este enfoque es un reto porque varios órganos sensoriales del oído interno contribuir al nervio VIII ^1. Además, los marcadores que distinguir confiablemente auditivo frente a los grupos vestibulares de los axones a la aviar nervio VIII aún no se han identificado. Vías auditivas y vestibular no pueden distinguirse funcionalmente en los embriones tempranos, como sensoriales evocados por las respuestas no están presentes antes de los circuitos se forman. Centralmente se proyectan axones del nervio VIII han sido localizados en algunos estudios, pero auditivo etiquetado axón fue acompañado por el etiquetado de otros componentes nerviosos VIII ^2,3. Aquí se describe un método para la anterógrada trazado del ganglio acústico para selectivamente label axones del nervio auditivo dentro VIII desarrollo. En primer lugar, después de la disección parcial de la región cefálica anterior de un embrión de pollo de 8-día sumergido en fluido cerebroespinal artificial oxigenado, el conducto coclear es identificado por puntos de referencia anatómicos. A continuación, una micropipeta fina tira de cristal está posicionado para inyectar una pequeña cantidad de rodamina dextrano amina en la región profunda del conducto y adyacente donde las células ganglionares de la acústicos se encuentran. Dentro de los treinta minutos después de la inyección, los axones auditivos se remontan centralmente en el cerebro posterior y más tarde se puede visualizar después de la preparación histológica. Este método proporciona una herramienta útil para los estudios de desarrollo de periféricos al centro de formación de circuito auditivo.

Protocolo

1. Preparar las herramientas de disección tras y Reactivos

Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa; 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH ₂ PO _4, 20 mM NaHCO _3, 3 mM de HEPES, 10 mM de glucosa, 2 mM CaCl _2, 1,3 mM MgSO ₄₎ continuamente infundido con 95% de O _2/5% CO ₂ a temperatura ambiente. Para la infusión, llene hasta 2/3 a 500 ml de boca ancha frasco Nalgene con un agujero perforado en la tapa. Tanque se fijan por medio de un tubo de vidrio vástago burbujeador, que penetra en el LCRa a través del agujero en la tapa del frasco. Ajustar la presión para obtener una corriente constante de burbujas que llegan a aproximadamente 1/3 del líquido, pero no son lo suficientemente fuerte como para causar salpicaduras sobre el borde. Sumergir 5 viales de vidrio ml (hasta 6) en el frasco Nalgene para separar las muestras individuales el uno del otro y de la turbulencia de flujo de gas. ACSF debe ser oxigenada durante al menos 20 min antes de cualquier tejido incubación.
Silicona pequeña placa de disección (35 mm x 10mm recubierto de Petri utilizando Sylgard élastomère Kit) con dos pernos de disección colocados en poliestireno hexagonal pequeño (47 mm inferior) pesan barco.
Dos pinzas de punta fina, una curva de punta de pinzas, un vaso de precipitados de 50 ml, y un contenedor para los residuos de tejido.
Sacó micropipeta de vidrio (1,2 OD / ID 0,9) rota a aproximadamente 20-50 micras abertura en la punta y se llena con rodamina dextrano amina (RDA, MW = 3.000, Invitrogen) en una solución de 6,25% con 0,4% Triton X-100 en PBS . Conecte mediante un tubo fino para picospritzer y estabilizar a micromanipulador.

2. Micro-disección de revelar Papilla basilar en ^4,5 E8

Con pinzas curvas, corte E8 embrión justo debajo del tronco cerebral, colocando la cabeza directamente sobre la placa de disección recubierto de silicona dentro peso barco.
Con los pernos de disección, la posición de la cabeza con una vista ventral por lo que el oído del lado de interés es ligeramente visible, la cabeza ligeramente inclinada hacia dorsal y apuntando 10-30 grados fuera de center (Figura 2A). Inmediatamente fijar el cabezal con pernos. Si se desea una localización bilateral, el centro de la cabeza a los 0 grados, o una vista ventral completo por lo que ambas partes pueden tener acceso. Del mismo modo, para una inyección del lado izquierdo, asegurar la cabeza de -10 a -30 grados desde el centro de manera que el lado izquierdo es accesible.
Usando el vaso de precipitados de 50 ml, transferir 30 ml de LCRa oxigenada en el plato, sumergiendo completamente el tejido.
Pellizque suavemente hacia abajo y la cáscara de la mandíbula inferior con unas pinzas de punta fina, luego retire el párpado inferior del lado de los intereses.
Retire el tejido vascular suprayacente, incluyendo cualquier paladar restante y garganta. Estos tejidos blandos pueden despegarse revelar la superficie lisa de desarrollar condrocráneo con las arterias vertebrales distintivas en su superficie. En este punto, la característica masa otoconial blanco debe ser visible.
Diseccionar cuidadosamente la piel alrededor del meato externo, el cartílago de la articulación de la mandíbula, y el oído medio, mientras que en el dejandoner oído intacto. Utilice las pinzas para cortar suavemente lejos estas estructuras cartilaginosas.
Quite las arterias vertebrales y la acumulación de sangre mediante un movimiento de barrido suave con las puntas de las pinzas finas. La sangre puede oscurecer vista y la coagulación puede tapar la abertura de la pipeta de inyección.
El conducto coclear con epitelio adyacente sensorial (papila basilar) y el ganglio acústico encuentra directamente debajo de la condrocráneo ⁶ y se puede visualizar como una forma alargada en forma de dedo saliente que se extiende desde el oído interno ventralmente, con la punta más distal (ápice) cerca de la anterior línea media ^5. Puede haber una pequeña acumulación de sangre (roja) de la disección y / o calcificaciones otolíticos (blanco) en el vértice de la cóclea del conducto (Figura 2B) que puede ayudar en la visualización. En el vértice es la mácula lagenar, un parche sensorial cree que la función vestibular ^7,8.

3. Etiquetado selectiva de CN VIII fibras auditivas

Coloque la pipeta de inyección cerca de la superficie del embrión en la región de la papila del conducto coclear y basilar.
Baje lentamente la micropipeta para perforar primero el cráneo. Esta región craneal es más delgada que las zonas circundantes y requiere menos fuerza para penetrar. La micropipeta ahora debe estar en el interior del conducto coclear. Opcional: una pequeña inyección de tinte trazado se puede hacer para ayudar en la visualización de la papila basilar.
Sin tener que reposicionar la micropipeta, seguir bajando hasta que sólo rompe la frontera profunda del conducto coclear (Figura 1). Realizar una inyección y repetir aquí en varias regiones a lo largo de la longitud de la papila basilar (figuras 2C, 2D), con exclusión de la punta más proximal donde la vestibular lagena se encuentra. Con la picospritzer establecido entre 10-30 psi, varias inyecciones se hacen. El volumen de fluido que se inyecta medio de contraste varía, y depende de la extensión de etiquetado deseado. Cada inyección debe dar lugar a un tinte fluorescente-lapunto Beled de aproximadamente 200 a 400 m de diámetro (Figura 2D).
Una vez que la inyección se ha completado, el uso de fórceps para seccionar la muestra por encima del tronco cerebral y el uso de una pipeta de transferencia para colocar la porción caudal en un pequeño frasco dentro del recipiente de LCRa continuamente se perfundieron con 95% O _2/5% CO _2.
Para cada embrión, 20-30 min para permitir la transferencia de colorantes, en función de la distancia del centro de trazado deseado.
Quitar el tejido y prepararse para el seccionamiento histológico. En el ejemplo que se muestra aquí, el tejido se sumerge en 4% de paraformaldehído (en 1X PBS) durante la noche sacarosa,% 30 (en 1X PBS) durante la noche.

4. Contratinción y Análisis

Contratinción es útil para ayudar a orientar al observador a la ubicación anatómica, así como la identificación de regiones particulares de interés. Una tinción de contraste eficaz en esta preparación es immunolabeling neurofilamentos (figuras 1, 3B, 3E), que fuertemente lAbels axones y permite la demarcación de las vías axonales en el SNC.
Análisis debe ser realizado en toda la región etiquetada, como las proyecciones pueden extenderse varios cientos de micras o más a lo largo del eje rostrocaudal. Algunos ejemplos de los análisis básicos son: las tasas de error de orientación, el tiempo y / o cambios en los patrones de divergencia de proyección. Axones marcados RDA-se visualizan en el sistema nervioso periférico y central con alta resolución (Figuras 3A, 3D).