Aquí describimos una técnica de microdisección seguida de la inyección de tinte fluorescente en el ganglio de la acústica de los primeros embriones de pollo para el seguimiento selectivo de las fibras auditivas axones en el nervio y cerebro posterior.
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Artículo de método
Rastreo Selectivo de Fibras auditivo en el nervio vestíbulo coclear aviar embrionarias
En este artículo
Resumen
Resumen
El embrión de pollo es un modelo ampliamente utilizado para el estudio de las proyecciones de células ganglionares centrales y periféricas. En el sistema auditivo, el etiquetado selectivo de los axones en el nervio auditivo craneal VIII aumentaría el estudio del desarrollo central de circuito auditivo. Este enfoque es un reto porque varios órganos sensoriales del oído interno contribuir al nervio VIII 1. Además, los marcadores que distinguir confiablemente auditivo frente a los grupos vestibulares de los axones a la aviar nervio VIII aún no se han identificado. Vías auditivas y vestibular no pueden distinguirse funcionalmente en los embriones tempranos, como sensoriales evocados por las respuestas no están presentes antes de los circuitos se forman. Centralmente se proyectan axones del nervio VIII han sido localizados en algunos estudios, pero auditivo etiquetado axón fue acompañado por el etiquetado de otros componentes nerviosos VIII 2,3. Aquí se describe un método para la anterógrada trazado del ganglio acústico para selectivamente label axones del nervio auditivo dentro VIII desarrollo. En primer lugar, después de la disección parcial de la región cefálica anterior de un embrión de pollo de 8-día sumergido en fluido cerebroespinal artificial oxigenado, el conducto coclear es identificado por puntos de referencia anatómicos. A continuación, una micropipeta fina tira de cristal está posicionado para inyectar una pequeña cantidad de rodamina dextrano amina en la región profunda del conducto y adyacente donde las células ganglionares de la acústicos se encuentran. Dentro de los treinta minutos después de la inyección, los axones auditivos se remontan centralmente en el cerebro posterior y más tarde se puede visualizar después de la preparación histológica. Este método proporciona una herramienta útil para los estudios de desarrollo de periféricos al centro de formación de circuito auditivo.
Protocolo
1. Preparar las herramientas de disección tras y Reactivos
- Líquido cefalorraquídeo artificial (LCRa; 130 mM NaCl, 3 mM de KCl, 1,2 mM KH 2 PO 4, 20 mM NaHCO 3, 3 mM de HEPES, 10 mM de glucosa, 2 mM CaCl 2, 1,3 mM MgSO 4) continuamente infundido con 95% de O 2/5% CO 2 a temperatura ambiente. Para la infusión, llene hasta 2/3 a 500 ml de boca ancha frasco Nalgene con un agujero perforado en la tapa. Tanque se fijan por medio de un tubo de vidrio vástago burbujeador, que penetra en el LCRa a través del agujero en la tapa del frasco. Ajustar la presión para obtener una corriente const....
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Resultados
Los componentes del nervio VIII y la anatomía del propio nervio son complejas y enrevesadas (Figuras 1, 3). Por selectivamente rastreo de fibras que surgen a partir de células ganglionares de la acústicos, los segmentos del nervio VIII, así como los aferentes primarios auditivas dentro del tronco encefálico puede ser limpiamente trazado y distinguirse de sus homólogos vestibulares (Figuras 2, 3). Del mismo modo, esta técnica podría ser utilizada para estudiar proyecciones periféricas de.......
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Discusión
Estudios sobre el desarrollo temprano del nervio VIII se han limitado, en parte debido a la dificultad en la identificación de los axones embrionarias derivadas de los ganglios de distinta múltiple. Varios estudios han explorado las señales moleculares que guían auditivo y vestibular célula sensorial y destinos de células ganglionares durante el desarrollo temprano, 5,11,12 pero los procesos que regulan la inervación central tienen todavía por determinar. Informes de acústicos proyecciones de células ganglion.......
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Divulgaciones
No hay conflictos de intereses se declaran.
Agradecimientos
Los autores desean agradecer a la Dra. Candace Hsieh para sugerencias y ayuda con técnicas de imagen y la Dra. Doris Wu por su experiencia en la anatomía del oído interno pollito durante la embriogénesis temprana. Este trabajo fue apoyado por NSF IOS-0642346, NIH T32-DC010775, NIH T32-GM008620, NIH R01-DC010796 y DOE GAANN P200A120165.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Nombre del reactivo / material | Empresa | Número de Catálogo | Comentarios |
| Poliestireno Pesar Dish | Fisher Scientific | 02-202-101 | |
| Placa de Petri de 35 x 10 mm | Fisher Scientific | 50820644 | Se utiliza para hacer plato de silicona disección |
| Kit de elastómero de silicona Sylgard | World Precision Instruments | SYLG184 | Escudo Petri plato para hacer la disección |
| Clavijas Dissection | Vario | Sostiene embrión en su lugar durante la disección | |
| NaCl | Vario | parte de la receta LCRa | |
| KCl | Vario | parte de la receta LCRa | |
| KH 2 PO 4 | Vario | parte de la receta LCRa | |
| NaHCO 3 | Vario | parte de la receta LCRa | |
| Glucosa | Vario | parte de la receta LCRa | |
| CaCl 2 | Vario | parte de la receta LCRa | |
| MgSO 4 | Vario | parte de la receta LCRa | |
| Contenedor para LCRa. Sugerir translúcido Nalgene de boca ancha jar, 500 ml (16 onzas) con tapa. | CPLabSafety | QP-PLC-03717 | Apertura taladro agujero en la parte superior de la tapa de vidrio del vástago bubling para penetrar líquido |
| Vacío 5 ml vial de vidrio o vial transparente comparable | American Pharmaceutical Partners, Inc | 6332300105 | usa durante la incubación LCRa para mantener las muestras separadas unas de otras y de la corriente de burbujeo |
| Tanque de carbógeno (95% O 2/5% CO 2) conectado mediante un tubo a burbujeador | Vario | Conecte mediante un tubo de vidrio pelele madre para infusión en LCRa | |
| Vidrio tallo burbujeador | Vario | Para infundir carbógeno en LCRa | |
| Curva de punta de pinzas | World Precision Instruments | 501008 | Para quitar la cabeza de embrión de huevo |
| Dos pinzas de punta fina | World Precision Instruments | 501985 | Para los micro-disección |
| 50 ml Vaso | vario | ||
| Rodamina dextrano Amine (RDA) | Invitrogen | vario | Fluorescente axón trazador |
| Triton X-100 | ICN Biomedicals | ||
| Solución salina tamponada con fosfato, (PBS 1X) | Vario | Reactivo de laboratorio estándar | |
| Pared Delgada capilares de vidrio, 1,2 OD, ID 0.9 de 4 "(100 mm) de longitud | World Precision Instruments | TW120F-4 | Cargue con RDA. Cada capilar hace dos micropipetas de vidrio |
| Aguja / extractor de pipetas | David Kopf Instruments | Modelo 720 | Ajustes utilizados: Calor 16,4, 2,2 solenoide |
| Picospritzer | Parker Instrumentation | vario | Conecte mediante un tubo fino de vidrio micropipeta |
| Micromanipulador | Narishige | vario | |
| Disección microscopio con fluorescencia | Vario | ||
| 4% de paraformaldehído | Vario | Reactivo de laboratorio estándar | |
| anticuerpo anti-neurofilamentos, opcional | Millipore | AB1991 | Seguir el protocolo recomendado por el fabricante histológico |
| Criostato y materiales conexos para seccionar | Leica | vario | |
| Microscopio de epifluorescencia para formación de imágenes | Zeiss, diversos |
Referencias
- Groves, A. K., Fekete, D. M. Shaping sound in space: the regulation of inner ear patterning. Development. 139, 245-257 (2012).
- Pflieger, J. F., Cabana, T. The vestibular primary afferents and the vestibulospinal pro....
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Reimpresiones y permisos
