Creación de degradados adhesivas y soluble para la migración celular con imágenes de microscopía de fluorescencia

Resumen

Un método para el montaje de gradientes adhesivas y soluble en una cámara de microscopía para estudios en vivo de células de migración se describe. El entorno de ingeniería combina superficies antiincrustantes y pistas adhesivas con gradientes de solución y por lo tanto permite determinar la importancia relativa de las señales de orientación.

Resumen

Las células se pueden detectar y migrar hacia mayores concentraciones de señales adhesivas tales como las glicoproteínas de la matriz extracelular y señales solubles tales como factores de crecimiento. Aquí, describimos un método para crear gradientes opuestos de señales adhesivas y soluble en una cámara de microfluidos, que es compatible con imágenes de células vivas. Un copolímero de poli-L-lisina y polietilenglicol (PEG-PLL) se emplea para pasivar cubreobjetos de vidrio y evitar la adsorción no específica de biomoléculas y células. Siguiente impresión, por microcontacto o inmersión litografía pluma se utilizan para crear pistas de estreptavidina en las superficies pasivadas para servir como puntos de anclaje para el péptido biotinilado arginina-glicina-ácido aspártico (RGD) como la señal adhesivo. Un dispositivo microfluídico se coloca sobre la superficie modificada y utilizada para crear el gradiente de las señales de adhesivo (100% RGD a 0% RGD) en las pistas de estreptavidina. Por último, el dispositivo de microfluidos mismo se utiliza para crear un gradiente de un éxito quimioatrayenteh como suero bovino fetal (FBS), como la señal soluble en la dirección opuesta de la pendiente de las señales adhesivas.

Introducción

La migración dirigida de células es una propiedad fundamental de muchas células y es un aspecto clave de muchos procesos fisiológicos normales, como el desarrollo embrionario, la defensa contra la infección y la cicatrización de heridas. Además, la migración celular también juega un papel importante en muchas enfermedades tales como enfermedad vascular, metástasis de células tumorales y ^1,2 inflamación crónica. Mientras que los estados clásicos de la migración celular - polarización, de extensión saliente, formación de adhesión, la generación de la fuerza y la retracción posterior - ^3,4 son generalmente aceptados, la elucidación de los mecanismos espaciotemporales por el cual coordina la señal de integración ha sido más difícil.

La matriz extracelular (ECM) sirve como sustrato para la adhesión celular, y por medio de química inherente ⁵ y ⁶ diversidad física, proporciona indicaciones direccionales para células de navegación ^7,8. Además de estas señales de adhesivo ^9, factores solubles ^{10-12 <}/ Sup> tales como quimiocinas y factores de crecimiento puede inducir la migración dirigida de células a través de receptores quimioatrayentes y su señalización aguas abajo motogénica. Actualmente, no se sabe si el compromiso y la señalización a través de receptores de adhesión (es decir, integrinas) o receptores quimioatrayentes, tales como receptores tirosina quinasa (RTK), son dominantes. Tampoco se sabe si las jerarquías de sistemas receptores son específicos del tipo celular.

Microscopia de células vivas da una gran cantidad de información que no es accesible en ensayos a granel y se pueden combinar con dispositivos de microfluidos para generar gradientes inmovilizados señales de ^13,14 y soluble ^{15 16.} El método aquí descrito utiliza una serie de pasos simples y establecidos para la modificación superficial en conjunción con una cámara de microfluidos disponible comercialmente para crear un ensayo de formación de imágenes para la migración celular que se puede implementar fácilmente en un laboratorio de biología celular (Figura 1). El ensambladodispositivo microfluídico tiene cualidades ópticas que sean comparables al vidrio ¹⁷ y los gradientes de moléculas difusibles son estables durante al menos 16 h. El sistema puede ser utilizado para las técnicas de microscopía de epifluorescencia y avanzada. A diferencia de otras configuraciones de quimiotaxis de ^18, este sistema es adecuado para la grabación lentamente migración, las células adherentes. Es importante destacar que el sistema es modular y permite fácilmente la introducción de adhesivo alternativa o señales solubles migración y el examen de diversos tipos de células.

Protocolo

1. Pasivación de Cubreobjetos de vidrio con PLL-PEG-biotina

Este paso está diseñado para neutralizar la superficie para que las células se adhieran y migrar hacia regiones específicas sobre el cubreobjetos de vidrio que se crean con la impresión microcontract (Paso 2-3a) o litografía de inmersión pluma (Step 3b). Para la pasivación, un co-polímero de poli-L-lisina (PLL) y polietilenglicol (PEG) se usa en la que 20% de las moléculas de PEG se injertan a biotina (PLL-PEG-biotina).

1. Para limpiar cubreobjetos de vidrio (18 mm x 18 mm), sumergir en un bastidor en el 100% de etanol y coloque el estante en un baño de tratamiento con ultrasonidos durante 30 min. Secar los cubreobjetos de vidrio en el aire o bajo una corriente de nitrógeno.
2. A continuación, sonicar los cubreobjetos de vidrio durante 30 minutos en 1 M NaOH. Luego enjuagar las superficies de vidrio por inmersión con cuidado la rejilla en una cubeta llena con 1,5 L Milli-Q H ₂ O. Repita el proceso de lavado tres veces con dulce Milli-Q H ₂ O cada vez. Secar los cubreobjetos de vidrio enun horno a 60 ° C.
3. Colocar la mitad del cubreobjetos de vidrio limpio individualmente en una cámara húmeda, que está hecho de una placa de 24-así parcialmente lleno con H ₂ O. Desechar 15 l de PLL-PEG-biotina (1 mg / ml) en PBS en cada cubreobjetos de vidrio. Tomar la otra mitad de los cubreobjetos de vidrio limpio y cuidadosamente restantes sándwich la solución de PEG. Agregar los cubreobjetos durante 1 h en la cámara húmeda. Deslice suavemente el cubreobjetos intercaladas de distancia el uno del otro sin raspar la superficie con recubrimiento de PEG y enjuagarlos con Milli-Q H ₂ O. El agua debe deslizarse fácilmente en el lado de PEG-tratada. Si es necesario, secado al aire los cubreobjetos de vidrio en una toalla de papel con la superficie tratada hacia arriba. La tienda de los cubreobjetos de vidrio en un desecador de vacío hasta su uso posterior.

2. La fabricación de sellos para la impresión por microcontacto

Se describen dos procesos a las pistas estreptavidina patrón sobre el cubreobjetos de vidrio pasivado. La primera de ellas, microcontact impresión, normalmente requiere la fabricación de un maestro de silicio a partir de la cual se moldea un sello de PDMS. En nuestro caso, el patrón en el sello de PDMS son 100 micras de ancho líneas que están espaciados 290 m de centro a centro con una altura característica de 25 micras. A continuación, se describe brevemente cómo fabricar un maestro de silicio adecuado (Paso 2.1-2.3) y el sello de PDMS (Paso 2.4). Sin embargo, existen varios protocolos para la impresión por microcontacto descritos en la literatura ^19-23, que son adecuadas para la impresión de los patrones de proteínas en cubreobjetos de vidrio. Masters también se pueden hacer de ratón y adquiridos de fuentes comerciales.

1. En primer lugar, limpiar la oblea de silicio (4 "de diámetro) mediante la incubación en una solución Piranha (3:1 v: v de ácido sulfúrico y 30% de peróxido de hidrógeno). Durante 20 min Enjuague a fondo la oblea 10 veces con MilliQ H ₂ O. Secar la oblea en un horno a 150 ° CO / N.
2. Enjuague la oblea de silicio limpia y se seca con 100% de acetona, seguido de 100% de alcohol isopropílico. Próximospin-capa 2 ml de GM1070 SU-8 fotorresistente (Gersteltec Sarl) sobre la oblea a 3.100 rpm durante 40 segundos para crear una capa de 25 micras de espesor. La muestra luego se cuecen al horno en una placa caliente a 65 ° C durante 5 min seguido de otros 5 min a 95 ° C.
3. Exponer el SU-8 fotosensible a la luz UV durante 60 segundos bajo una fotomáscara con el patrón deseado (por ejemplo, utilizando una máscara de alineador Quintel Q6000) y repita el proceso de cocción describen en 2.2. Después, la muestra se desarrolla mediante la inmersión de la oblea en SU-8 programador (Gersteltec Sarl) durante 4 min, se lavaron en 100% de alcohol isopropílico y se secó bajo un flujo de nitrógeno. El área de la SU-8 fotorresistente que no se expuso a luz UV queda así eliminado, creando el patrón inverso del sello PDMS.
4. El siguiente paso consiste en emitir un sello PDMS desde el maestro de silicio. En primer lugar, mezclar cuidadosamente 1 parte (w / w) del agente de curado con 10 partes de prepolímero elastómero (Sylgard 184). Para eliminar las burbujas de aire, desgasificar la mezcla en un desecador conectado a una línea de vacíodurante 1 h. A continuación, verter el elastómero PDMS en el patrón de silicio en el interior de una caja de Petri a aproximadamente 1 cm de altura y curar la mezcla maestra y PDMS en un horno a 70 ° C durante 1 hr. Por último, el sello de PDMS se retira desde el maestro de silicio y cortar a medida.

3. Patrones estreptavidina o Cues adhesivas en cubreobjetos de vidrio pasivado

Después de pasivación cubreobjetos de vidrio, los patrones de proteínas se imprimen con impresión por microcontacto (Paso 3a) o dip-pen litografía (Step 3b). En nuestro caso, la estreptavidina se imprimen como líneas, que forman la base de los gradientes de RGD (Paso 4). El mismo procedimiento también se puede utilizar para la impresión de proteínas de la matriz para crear patrones adhesivos.

Un método alternativo para la impresión por microcontacto para el modelado de biomoléculas en las superficies de inmersión es la litografía pluma. En la litografía de inmersión pluma, un voladizo se utiliza para transferir un pequeño volumen de solución en la superficie. El tamaño de los voladizos, viscosity de la solución, tiempo de contacto de la viga en voladizo sobre la superficie, hidrofobicidad de la superficie y de la humedad en la cámara de impresión determinar el tamaño de los elementos impresos. La ventaja de este método es que los diferentes patrones pueden imprimirse para cada experimento, ya que no hay necesidad de fabricar maestros y sellos. La desventaja es que se necesita más tiempo para imprimir un patrón dado y que dip litografía pluma requiere un instrumento especializado que puede no estar disponible en muchos laboratorios. La plumilla litografía instrumento que se utilizó fue el de NanoeNabler Bioforce Nanociencia. En este sentido, impreso pequeños puntos que eran <10 micras de diámetro, para lo cual utilizamos SPT10 voladizos.

3a. La impresión por microcontacto (μCP) Técnica

1. Para limpiar y hacer el sello PDMS más hidrófilo, tratar el lado estampado de los sellos de PDMS en un UV y ozono (por ejemplo, Procleaner ozono UV de Bioforce Nanociencia) durante 1,5 h. También puede utilizar un plasmalimpiador para un tiempo más corto para el mismo propósito. Este proceso crea un oxidó PDMS superficie ^24, lo que mejora el proceso de impresión.
2. Inmediatamente después del tratamiento con ozono o plasma, el lugar y se extendió 10 l de estreptavidina (1 mg / ml en PBS) en los sellos de PDMS y dejar durante 1 hora en una cámara húmeda (como un parcialmente lleno 6-así placa, ver paso 1,3) . Si las pistas deben ser visibles bajo el microscopio de fluorescencia, que es usar estreptavidina conjugada con un fluoróforo tal como estreptavidina-AlexaFluor350.
3. Eliminar el exceso de estreptavidina con el sello de papel de seda y secar al aire el sello durante aproximadamente 1 min. Presione ligeramente el sello sobre el cubreobjetos de cristal PLL-PEG-biotina-revestido.
4. Si fluorescente estreptavidina se utilizó en 3.A2 Paso, examinar el patrón de uso bajo un microscopio de epifluorescencia. La tienda de superficies impresas en un desecador.

3b. Dip Litografía Pen

1. Primero, mezclar 1 parte de 1 mg / ml de estreptavidina o streptavidin-AlexaFluor350 con 10 partes de glicerol (v / v) y cargar 5 l de la mezcla sobre la viga en voladizo. Entonces comienza el proceso de impresión como se describe en el manual de funcionamiento del instrumento de inmersión litografía pluma. Para reducir el tamaño del punto a aproximadamente 5 micras, ajustar la velocidad de impresión, el tiempo de contacto de la viga en voladizo sobre la distancia de la superficie o vertical de la viga en voladizo a la superficie. En el ejemplo mostrado en la Figura 2c, los puntos se imprimen en una línea con la fila y la columna de separación ajustado a 10-15 micras. Esta distancia es suficiente para evitar puntos de fusión entre sí, sino que permite la visualización de múltiples puntos en un único campo de visión con la configuración de la mayoría de microscopio.
2. La tienda de superficies impresas en un desecador.

4. Crear gradientes de adhesivo sobre las superficies de patrón de estreptavidina

Hemos crear gradientes de adhesivo de biotina-RGD en cubreobjetos de vidrio que están recubiertas con estreptavidina (Figura 3) o contain estreptavidina patrones en cubreobjetos de vidrio pasivadas (Figura 5). Para crear un gradiente de la superficie, se utilizó un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente (llamado pegajoso-Slide ^3D ​​quimiotactismo de ibidi) que crea un gradiente de solución estable por difusión pasiva. Para competir por los sitios de unión de estreptavidina, se emplearon dos gradientes opuestos de biotina-RGD y la biotina que no se conjugó con RGD (ver Figura 1).

1. Respete los cubreobjetos con dibujos o recubiertas de estreptavidina vidrio sobre la parte adhesiva del dispositivo pegajoso-Slide quimiotaxis ^3D. Para asegurarse de que no hay fugas durante varias horas, los bordes del dispositivo están sellados con una capa fina de vaselina y se calentó con una segunda capa de una mezcla de 1 parte de vaselina a 1 parte de cera de parafina (w / w).
2. Rellene el canal del dispositivo con 6 l de PBS en el canal. A continuación, llenar los dos depósitos de 70 l de 0,03 mg / l de biotina-4-fluoresceína en PBS y 70 & mu; l de 0,03 mg / l de biotina-RGD en PBS, respectivamente. Se incuban las muestras a temperatura ambiente en la oscuridad durante 1 hr.
3. Eliminar la biotina y soluciones de enjuague cuidadosamente la superficie mientras todavía están unidos al dispositivo de microfluidos dos veces con PBS. Marcar la dirección del gradiente de adhesivo y, si es necesario, almacenar el dispositivo lleno de PBS a 4 ° C durante pero asegurar que el dispositivo no se seque. Si es necesario, analizar gradiente de adhesivo con un microscopio de fluorescencia.

5. El etiquetado de las células con fluoróforos de imágenes de células vivas

Las células se marcan con tintes fluorescentes que ayudan rastreo celular bajo el microscopio fluorescente. Sondas fluorescentes comunes son marcadores de orgánulos, tales Syto 64 rojas, que etiqueta el núcleo de la célula. Para ello, las células se lavaron primero tres veces con PBS, después se incubaron con 1 mM Syto 64 Red en medios de cultivo durante 45 min y finalmente se lava otras tres veces con PBS. Tenga en cuenta que las células no debería sermantenido en PBS durante largos períodos de tiempo.

Tintes alternativos para rastreo celular son serie CellTracker que tiñen el citoplasma y se conservan durante la migración celular y la división. La transfección de células con proteína de fusión fluorescente es particularmente útil para registrar las distribuciones subcelulares de una proteína de interés durante la migración. Sin embargo, las proteínas fluorescentes típicamente foto-blanqueador más rápido que los tintes orgánicos para que las observaciones a largo plazo puede no ser posible.

6. Carga de células con un degradado soluble en el dispositivo de microfluidos

1. Contar las células marcadas fluorescentemente y se dividió en dos tubos del número de células iguales. Lavar y volver a suspender las células de un tubo con medio que contenía el quimioatrayente, tales como el medio modificado de Dulbecco bajo en glucosa Eagle (DMEM) con suero fetal bovino al 10% (FBS). Lavar y resuspender el otro tubo de células en medios sin el quimioatrayente, es decir, DMEM con FBS al 0%. La concentración finalde células en cada tubo debe ser de 5 x 10 ⁵ células / ml.
2. Quite todas las soluciones desde el dispositivo de microfluidos (del Paso 4.3) y colocarlo en la platina del microscopio (ver paso 7). Carga de 70 l de células (5 x 10 ⁵ células / ml en DMEM FBS 0%) en uno de los depósitos y 70 l de células HeLa (5 x 10 ⁵ células / ml en DMEM FBS 10%) en otro. Libremente colocar una cinta adhesiva sobre los depósitos para evitar la evaporación. Si las células en la superficie son pre-incubados antes de la formación de imágenes, es aconsejable que las células se cargan en el dispositivo en medios de crecimiento sin el gradiente. El dispositivo se coloca sobre la platina del microscopio y los medios de comunicación sustituido con gradiente de medios de comunicación, es decir DMEM sin ​​FBS en un depósito y DMEM con FBS al 10% en el otro.

7. Vivo de imágenes de células y análisis de datos

1. Encender el microscopio (Nikon Ti-E) y calentar la fase de por lo menos 1 hora antes de comenzar el experimento.
2. Asegúrese de que el canal de la microfluidic dispositivo está en el campo de visión y las células están en foco. Seleccionar el parámetro de adquisición de imágenes, tales como tiempos de exposición y filtros fluorescentes, secuencia de imágenes de campo claro y fluorescencia, que captura las células y las pistas, así como los momentos de tiempo y duración de grabación (por ejemplo, cada 15 min durante 16 h).
3. Analizar los datos con los programas informáticos adecuados, como ImageJ Manual Tracking o ibidi quimiotaxis y migración.

Resultados

Para entender cómo integrar las señales de células migratorias ^25, hemos desarrollado un método para celdas de imagen con microscopía de fluorescencia que migrar en un entorno con gradientes compitiendo adhesivas y soluble (Figura 1). Pistas adhesivas que contenían estreptavidina fluorescente y RGD biotinilado se han creado con pistas impresas por microcontacto y dip litografía pluma (Figura 2). Impresión por microcontacto éxito es indicado por el perfil de la línea de la int...

Discusión

En este protocolo, se utiliza un dispositivo de microfluidos disponible comercialmente (pegajoso-Slide ^3D ​​quimiotactismo de ibidi) para estudiar los efectos de las superficies modificadas químicamente y gradientes quimiotácticos sobre la migración celular. Esta configuración no requiere microfluídico de flujo porque el gradiente se establece por difusión a lo largo de la longitud del canal. Esto es importante porque el flujo podrían afectar diferencialmente a células que migran lentamente, tales como fibrob...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Trajes de tinción de cubreobjetos	Thomas Scientific	8542 E40	Rejilla de cubreobjetos
Aglutinante		de horno	ED 53 series
Oblea de	silicio Silicon Quest	708-007	Boro dopado < 100> oblea, 4" de diámetro, 500 μ m, pulido por una cara
GM1070 SU-8 fotorresistente	Gersteltec Sarl
Revelador SU-8	Gersteltec Sarl
Sylgard 184 agente de curado	Dow Corning
Sylgard 184 prepolímero de elastómero	Dow Corning
PLL-PEG-biotina (20%)	SuSos AG	PLL(20)-g[3.5]-PEG(2)/PEG(3.4)-Biotina (20%)	1 mg/ ml en PBS
Fluoresceína	Sigma	46955	1 mM en PBS
Estreptavidina-AlexaFluor350	Invitrogen	S-11249	1 mg/ml en PBS
Biotina-4-fluoresceína	Invitrogen	B-1370	0,03 μ g/μ l en PBS
Biotina-RGD	GenScript	SC1208	0,03 mg/ml en PBS
Syto 64 Red	Invitrogen	S-11346	1 μ M en PBS
Quimotaxis de portaobjetos pegajosos 3D	Ibidi	80328
200 μ l Punta biselada amarilla Greiner	Greiner Bio-One	739261
Vaselina	Sigma	16415
Cera de parafina, mp 55-57 ° C	Sigma	327204
Nano eNabler 10 μ m voladizo	BioForce	SPT-S-C-10s
Image J software	Instituto Nacional de Salud		rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Manual Tracking plugin	Fabrice Cordeliè res		rsb.info.nih.gov/ij/plugins/track/track.html
Herramienta de Quimiotaxis y Migración	Ibidi GmbH		www.ibidi.com/applications/ap_chemotaxis.html