Artículo de método
En este video, vamos a demostrar cómo registrar la actividad eléctrica de las neuronas individuales identificadas en una preparación de todo el cerebro, que preserva los circuitos neuronales complejas. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con una proteína fluorescente para la identificación en la preparación cerebro intacto.
La comprensión de la fisiología de la célula de los circuitos neuronales que regulan comportamientos complejos es mejorada en gran medida mediante el uso de sistemas modelo en el que este trabajo se puede realizar en una preparación de cerebro intacto, donde los circuitos neuronales del sistema nervioso central se mantiene intacta. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con la proteína verde fluorescente para la identificación en el cerebro intacto. Los peces tienen múltiples poblaciones de neuronas de GnRH, y sus funciones son dependientes de su ubicación en el cerebro y el gen de la GnRH que expresan 1. Nos hemos centrado nuestra demostración en GnRH3 neuronas localizadas en los nervios terminales (TN) asociados con los bulbos olfativos utilizando el cerebro intacto de medaka peces transgénicos (Figura 1B y C). Los estudios sugieren que las neuronas medaka TN-GnRH3 son neuromodulador, que actúa como un transmisor de la información desde el entorno externo al sistema nervioso central; tbueno no jugar un papel directo en la regulación de las funciones de la hipófisis-gonadal, al igual que el conocido hipotalámico neuronas GnRH1 2, 3. El patrón tónico del potencial de acción espontánea descarga de las neuronas TN-GnRH3 es una propiedad intrínseca 4-6, la frecuencia de la cual es modulada por señales visuales de sus congéneres 2 y el neuropéptido kisspectina 1 5. En este vídeo, se utiliza una línea estable de medaka transgénico en el que las neuronas TN-GnRH3 expresan un transgén que contiene la región promotora del Gnrh3 vinculada a una mayor proteína verde fluorescente 7 de mostrarle la forma de identificar las neuronas y controlar su actividad eléctrica en todo el cerebro preparación 6.
1. La disección de los cerebros de Medaka Adulto
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Un ejemplo de grupos bilaterales de GFP-etiquetados TN-GnRH3 neuronas del cerebro extirpado de medaka peces se muestran en las Figuras 1B y 1C. Cada grupo contiene aproximadamente 8-10 neuronas GnRH. Las actividades neuronales espontáneas de la meta TN-GnRH3 se registraron en el modo de abrazadera de corriente (I = 0) con tasas de disparo típicas de 0,5-6 Hz. El modelo de potencial de acción disparando es típicamente un patrón tónico o golpear, con un intervalo bastante regular interspi.......
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GnRH 3: GFP peces transgénicos proporcionan modelos únicos para estudiar los mecanismos neurofisiológicos que subyacen a la integración y la regulación en el control central de los comportamientos que están directa e indirectamente involucrados en la reproducción 3, 8-10 neuronal. Una de las ventajas significativas de este sistema de modelo es que muchos GnRH3 neuronas que expresan GFP se encuentran cerca de la superficie ventral del cerebro, lo que permite un acceso relativamente fácil a las neurona.......
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Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecemos al Dr. Meng-Chin Lin y la Sra. Yuan Dong de asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por una beca de los Institutos Nacionales de Salud HD053767 (subcontrato a NLW) y por fondos del Departamento de Fisiología y la Oficina del vicerrector de Investigación de la Universidad de California-Los Ángeles (NLW).
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Microscopio | Olympus | BX50W (Upright) | |
| Amplificador | Axon Instruments | Axoclamp 200B | |
| Convertidor A-D | Computer Interference Corp. | Digidata ITC-18 | |
| Cámara CCD refrigerada | PCO Óptica | Sensicam | |
| Lámpara de xenón | Sutter Instruments Co. | ||
| Juego de filtros GFP | Chroma Technologies | ||
| Software de adquisición de imágenes | Intelligent Imaging Innovations Software de libro de | diapositivas | |
| Software de adquisición de datos de electrofisiología | Software de axografía Axon Instruments | Software | |
| adquisición de datos de electrofisiología | AD Instruments Inc. | PowerLab | |
| Headstage para electrofisiología | Axon Instruments | CV 203BU | |
| Micromanipulador | Sutter Instrument Co | MP-285 | |
| Plataforma de cámara de grabación | Warner Instrument Corp. | P1 | |
| Warner Instrument Corp. | RC-26G | ||
| Extractor de electrodos | Sutter instruments | P87 | |
| Filamento para extractor de electrodos | Sutter Instruments | FB330B | Filamento de canal de 3,0 mm de ancho |
| Capilares de vidrio de 1,5 mm | World Precision Instruments | 1B150-4 | Micr– lectrode para grabación |
| Jeringa | Becton Dickinson | 309586 | 3 ml |
| MS-222 | Sigma | E10521-10G | Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato |
| Salina de pescado | mM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES | ||
| Solución de electrodos (parche suelto) | mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2,5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; Solución de electrodo de 10 glucosa | ||
| (parche de célula completa) | mM: 112,5 K-gluconato; NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 leupeptina; 10 fosfocreatina |
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