Registro de la actividad eléctrica de las neuronas identificadas en el cerebro intacto de peces transgénicos

Resumen

En este video, vamos a demostrar cómo registrar la actividad eléctrica de las neuronas individuales identificadas en una preparación de todo el cerebro, que preserva los circuitos neuronales complejas. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con una proteína fluorescente para la identificación en la preparación cerebro intacto.

Resumen

La comprensión de la fisiología de la célula de los circuitos neuronales que regulan comportamientos complejos es mejorada en gran medida mediante el uso de sistemas modelo en el que este trabajo se puede realizar en una preparación de cerebro intacto, donde los circuitos neuronales del sistema nervioso central se mantiene intacta. Utilizamos los peces transgénicos en los que las neuronas de hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) etiquetados genéticamente con la proteína verde fluorescente para la identificación en el cerebro intacto. Los peces tienen múltiples poblaciones de neuronas de GnRH, y sus funciones son dependientes de su ubicación en el cerebro y el gen de la GnRH que expresan ^1. Nos hemos centrado nuestra demostración en GnRH3 neuronas localizadas en los nervios terminales (TN) asociados con los bulbos olfativos utilizando el cerebro intacto de medaka peces transgénicos (Figura 1B y C). Los estudios sugieren que las neuronas medaka TN-GnRH3 son neuromodulador, que actúa como un transmisor de la información desde el entorno externo al sistema nervioso central; tbueno no jugar un papel directo en la regulación de las funciones de la hipófisis-gonadal, al igual que el conocido hipotalámico neuronas GnRH1 ^{2, 3.} El patrón tónico del potencial de acción espontánea descarga de las neuronas TN-GnRH3 es una propiedad intrínseca ^4-6, la frecuencia de la cual es modulada por señales visuales de sus congéneres ² y el neuropéptido kisspectina 1 ^5. En este vídeo, se utiliza una línea estable de medaka transgénico en el que las neuronas TN-GnRH3 expresan un transgén que contiene la región promotora del Gnrh3 vinculada a una mayor proteína verde fluorescente ⁷ de mostrarle la forma de identificar las neuronas y controlar su actividad eléctrica en todo el cerebro preparación ^6.

Protocolo

1. La disección de los cerebros de Medaka Adulto

1. Anestesie adulto hombre o mujer (Figura 1A) por inmersión en 5 ml MS-222 (150 mg / L, pH 7,4), esperar un par de minutos después de los movimientos branquias han dejado antes de decapitar. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión de la Universidad de California-Los Angeles.
2. Decapitar a los peces en solución salina peces en el extremo caudal del opérculo con unas tijeras en la placa de Petri de un diámetro de 60 mm.
3. Transferencia de cabeza de pescado con un diámetro placa de Petri de 35 mm, la mitad llenos de peces de solución salina y forrado con Sylgard que tiene una depresión en él para posicionar y sujetar la cabeza para la disección del cerebro. Coloque y asegure la cabeza dorsal hacia arriba con alfileres de insectos.
4. Corte con cuidado la parte dorsal del cráneo alrededor de su perímetro con unas tijeras finas y retírela con una pinza, dejando al descubierto la parte dorsal del cerebro, incluyendo completamente la parte anterior de la médula espinal.
5. Levante la médula espinal suavemente con unas pinzas de punta fina y cortar los nervios conectivos bilaterales con tijeras de punta fina: nervios craneales, nervios espinales y nervios ópticos en la parte ventral del cerebro y los nervios olfatorios en la parte anterior del el cerebro.
6. Coloque el cerebro totalmente disecado en una placa de Petri fresca llena de solución salina peces y comprobar cuidadosamente bajo el microscopio para asegurar todo el cerebro está intacto (incluyendo la glándula pituitaria) sin ningún tipo de cortes o pinchazos. Cerebros dañados no son utilizados para la experimentación.

2. Montaje del cerebro en una cámara de registro

1. Coloque una pequeña gota de cianoacrilato o algún otro pegamento de acción rápida con una aguja en el centro de la cámara de registro y difundir el pegamento alrededor de 1 cm ^2.
2. Transferir rápidamente el cerebro y la cola hacia abajo en una posición hacia arriba ventral-lateral.
3. Añadir 1 ml de solución salina peces para que llene la cámara de grabación y cubre el cerebro. Continuamente perfundirel cerebro con solución salina aireada pescado a una velocidad de al menos 200 l / min.
4. Uso del fórceps de punta fina quitar cuidadosamente las meninges sobre la superficie del área de grabación del cerebro.

3. Electrofisiología

1. Grabación de patch Loose del potencial de acción disparando
   1. Microelectrodos de vidrio (6-10 mW) se construyen a partir de pipetas de vidrio de borosilicato (1B150F-4, World Precision Instruments) con un extractor de electrodos (por ejemplo, Sutter P-87), y la espalda llena de la solución de grabación loose-patch media altura del electrodo.
   2. El uso de un microscopio de fluorescencia en posición vertical con un dispositivo de acoplamiento de carga enfriado (CCD), encontrar la expresión de GFP-TN-GnRH3 las neuronas a través de 10 veces (Figura 1B), a continuación, objetivos de inmersión en agua 40x (Figura 1C). Ellos se encuentran en o cerca de la superficie ventral de los bulbos olfativos, justo anterior a la telencéfalo.
   3. Cambie a un monitor de video que proporcionaimágenes en tiempo real desde el microscopio para localizar la neurona grupo TN-GnRH3 (Figura 1C).
   4. Coloque el microelectrodo en el baño de modo que la punta del electrodo está por encima de la neurona diana. Aplique ligera presión positiva constante a la microelectrodos para que no se obstruya, y acercarse suavemente la neurona diana con la punta del electrodo.
   5. Controlar y vigilar la resistencia del electrodo en el modo de fijación de voltaje con el software AxoGraph y el amplificador Axoclamp 200B con software AxoGraph (Axon Instruments). Cuando se puede ver en el monitor de vídeo que la punta del electrodo está en la superficie de la neurona y de la pantalla AxoGraph que la resistencia cambia ligeramente, liberar la presión positiva y aplicar una ligera presión negativa si es necesario para hacer un sello de baja resistencia en la neurona (<100 M).
   6. Cambie al modo de corriente-clamp, y registrar el voltaje de la membrana continua sin ninguna entrada de corriente, el ajuste de la escalade la tensión y la velocidad de grabación si es necesario. Los datos son recogidos y analizados por el software Powerlab (ADInstruments Inc.).
   7. Línea de base registrar la actividad eléctrica en solución salina normal pescado durante aproximadamente 5 minutos antes de cualquier tratamiento (Figura 2A). Bath perfusión de fármacos, hormonas, péptidos, etc. añadido a la solución salina peces continúa a una velocidad de 200 l / min, seguido por un período de lavado en solución salina normal peces ^{5, 6, 11.}
2. Grabación de células enteras de potencial de membrana
   El conjunto de patch clamp procedimiento electrofisiológico celular es la misma que la del procedimiento de grabación sueltas parche extracelular se ha descrito anteriormente, de los pasos 3.1.1 - 3.1.4. A continuación, los procedimientos se desvían en consecuencia:
   1. Controlar y vigilar la resistencia del electrodo en el modo de fijación de voltaje. Cuando se puede ver en el monitor de vídeo que la punta del electrodo está en la superficie de la neurona y desde el osciloscopio que los cambios en la resistencia ligeramente, liberan el positivopresión y aplicar un poco de presión negativa para hacer un sello de alta resistencia de la neurona (~ 3 Giga Ω). Aplicar una suave succión por la boca a la ruptura de la membrana parcheado, podrás ver una caída brusca de la resistencia a alrededor de 120 a 250 mW.
   2. Cambie al modo de corriente-clamp, y registrar el voltaje de la membrana continua sin ninguna entrada de corriente, el ajuste de la escala de voltaje y velocidad de grabación si es necesario.
   3. Línea de base registrar la actividad eléctrica en solución salina normal pescado durante aproximadamente 5 minutos antes de cualquier tratamiento, como se describió anteriormente en 3.1.7 (Figura 2B).

Resultados

Un ejemplo de grupos bilaterales de GFP-etiquetados TN-GnRH3 neuronas del cerebro extirpado de medaka peces se muestran en las Figuras 1B y 1C. Cada grupo contiene aproximadamente 8-10 neuronas GnRH. Las actividades neuronales espontáneas de la meta TN-GnRH3 se registraron en el modo de abrazadera de corriente (I = 0) con tasas de disparo típicas de 0,5-6 Hz. El modelo de potencial de acción disparando es típicamente un patrón tónico o golpear, con un intervalo bastante regular interspi...

Discusión

GnRH 3: GFP peces transgénicos proporcionan modelos únicos para estudiar los mecanismos neurofisiológicos que subyacen a la integración y la regulación en el control central de los comportamientos que están directa e indirectamente involucrados en la reproducción ^{3, 8-10} neuronal. Una de las ventajas significativas de este sistema de modelo es que muchos GnRH3 neuronas que expresan GFP se encuentran cerca de la superficie ventral del cerebro, lo que permite un acceso relativamente fácil a las neurona...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Microscopio	Olympus		BX50W (Upright)
Amplificador	Axon Instruments		Axoclamp 200B
Convertidor A-D	Computer Interference Corp.		Digidata ITC-18
Cámara CCD refrigerada	PCO Óptica		Sensicam
Lámpara de xenón	Sutter Instruments Co.
Juego de filtros GFP	Chroma Technologies
Software de adquisición de imágenes	Intelligent Imaging Innovations Software de libro de		diapositivas
Software de adquisición de datos de electrofisiología	Software de axografía Axon Instruments		Software
adquisición de datos de electrofisiología	AD Instruments Inc.		PowerLab
Headstage para electrofisiología	Axon Instruments		CV 203BU
Micromanipulador	Sutter Instrument Co	MP-285
Plataforma de cámara de grabación	Warner Instrument Corp.		P1
	Warner Instrument Corp.		RC-26G
Extractor de electrodos	Sutter instruments		P87
Filamento para extractor de electrodos	Sutter Instruments	FB330B	Filamento de canal de 3,0 mm de ancho
Capilares de vidrio de 1,5 mm	World Precision Instruments	1B150-4	Micr– lectrode para grabación
Jeringa	Becton Dickinson	309586	3 ml
MS-222	Sigma	E10521-10G	Sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato
Salina de pescado			mM: 134 NaCl; 2,9 KCl; 2,1 CaCl2; 1,2 MgCl2; 10 HEPES
Solución de electrodos (parche suelto)			mM: 150 NaCl; 3,5 KCl; 2,5 CaCl2; 1.3 MgCl2; 10 HEPES; Solución de electrodo de 10 glucosa
(parche de célula completa)			mM: 112,5 K-gluconato; NaCl; 17,5 KCl; 0,5 CaCl2; 1 MgCl2; 5 MgATP; 1 EGTA; 10 HEPES; 1 GTP; 0,1 leupeptina; 10 fosfocreatina