En el presente protocolo, se demuestra un método de purificación de proteínas a pequeña escala altamente eficiente y rentable, que permite la purificación de proteínas recombinantes, combinando de forma única una etiqueta de GST escindible y una pequeña cola de His.
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Artículo de método
GST-Su purificación: A dos pasos Affinity Protocolo Purificación Cediendo largos proteínas purificadas
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Resumen
Resumen
Ensayos de clave en enzimología para la caracterización bioquímica de las proteínas in vitro requieren altas concentraciones de la proteína purificada de interés. Protocolos de purificación de proteínas deben combinar eficiencia, simplicidad y rentabilidad 1. Aquí, describimos la GST-Su método como un nuevo sistema de purificación por afinidad a pequeña escala para proteínas recombinantes, sobre la base de un N-terminal de la etiqueta glutatión Sepharose (GST) 2,3 y una etiqueta 10xHis C-terminal 4, que tanto se fusionan a la proteína de interés. La última construcción se utiliza para generar baculovirus, para la infección de las células Sf9 infectadas para la expresión de proteínas 5. GST es una etiqueta bastante largo (29 kDa), que sirve para asegurar la eficacia de la purificación. Sin embargo, podría influir en las propiedades fisiológicas de la proteína. Por lo tanto, en que posteriormente se escinde la proteína usando la enzima PreScission 6. Con el fin de garantizar la máxima pureza y para eliminar el GST escindido, nosañadido una segunda etapa de purificación de afinidad basada en la comparativamente pequeña etiqueta de His. Es importante destacar que, nuestra técnica se basa en dos etiquetas diferentes que flanquean los dos extremos de la proteína, que es una herramienta eficaz para eliminar las proteínas degradadas y, por lo tanto, enriquece proteínas de longitud completa. El método que aquí se presenta no requiere una configuración fundamental caros, tales como FPLC. Además, incorporamos MgCl 2 y lavados ATP para eliminar las impurezas de la proteína de choque de calor y tratamiento con nucleasa de abolir ácidos nucleicos contaminantes. En resumen, la combinación de dos etiquetas diferentes que flanquean el N-y C-terminal y la capacidad de escindir una de las etiquetas, garantiza la recuperación de una proteína altamente purificada y de longitud completa de interés.
Introducción
La purificación de proteínas recombinantes es crucial para hacer frente a cuestiones fundamentales de la bioquímica. Formas convencionales de purificación de proteínas, como la cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de exclusión por tamaños se basan en las propiedades físicas de la proteína diana, como su punto isoeléctrico y la carga o el tamaño, respectivamente. Las características de proteínas últimos son compartidos por una variedad de proteínas, lo que aumenta considerablemente la probabilidad de proteínas contaminantes en las estrategias de purificación de proteínas convencionales. Este problema puede ser evitado con el uso de múltiples columnas de....
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Protocolo
1. Producción de baculovirus recombinante
Los baculovirus son generados utilizando el sistema de expresión de baculovirus Bac-to-Bac de Invitrogen principalmente de acuerdo con el protocolo del fabricante con modificaciones sólo leves:
- A pFastBac1 vector modificado (Gibco, la vida) fue creado que contiene el GST y Sus etiquetas (Figura 2). El sitio de clonación múltiple (MCS) de un pET-52b (+) vector (Novagen), que contiene una 10xHis-tag, se insertó en el MCS de un vector pFastBac1 generar pFastBac1-Strep-10xHis. La secuencia de MCS pET-52b (+) fue amplificado por PCR entre los sitios de restricción XbaI y BLP....
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Resultados
Con el fin de ilustrar la eficiencia de la GST-Su protocolo de purificación, purificamos Rec14, un S. pombe proteína de 32,9 kDa. El cDNA fue clonado Rec14 en nuestro vector pFastBac1 modificado que permite la adición de GST-y sus etiquetas en el extremo N-y C-terminales, respectivamente (Figura 1 A). El baculovirus recombinante se prepararon entonces y se utilizan para infectar células SF9 infectadas para la expresión de proteínas. Los lisados celulares solubles se incubaron con perlas de GS.......
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Discusión
El GST-Su protocolo de purificación que aquí se presenta es adecuado para la purificación de una amplia gama de tamaños de proteínas recombinantes: Se purificaron con éxito Li RAD51 (41kDa), piBRCA2 (120 kDa), PALB2 (130kDa), y una proteína de alto peso molecular inestable peso de Leishmania infantum: Li BRCA2 (125kDa) 6,9. Por otra parte, las proteínas purificadas con este protocolo eran bioquímicamente activa 6. El éxito de este método depende únicamente de la expresión, solubil.......
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Agradecimientos
Damos las gracias a Anne-Marie Dion-Cote para los debates que conducen al desarrollo del método. JK y RB son FQNRT académicos de doctorado, M.-MG es un erudito Vanier CIHR, y J.-YM es un investigador senior FRSQ. Este trabajo fue apoyado por fondos de las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de JY. M.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| REACTIVOS | |||
| E.Coli DH10Bac (competente) | Invitrogen | ||
| Bac-to-Bac Sistema de Expresión de Baculovirus | Invitrogen | ||
| Maxi Prep Kit | Qiagen | 12163 | Solución I y II |
| Ultra Puro Bluo-Gal | Gibco (Vida) | 15519028 | |
| IPTG | Gibco (Vida) | 15529019 | |
| células infectadas Sf9 | ATCC | CRL-1711 | |
| Enzima PreScission | Healthcare | 27084301 | |
| el medio infectado de Grace suplementado | Gibco (Life) | 11605-094 | |
| Suero Fetal Bovino Caracterizado | Hyplona | SH30396.03 | |
| P/S (Penicilina-Estreptomicina) | Gibco (Vida) | 15070-063 | |
| Resina de glutatión Sepharose | GE bioscience | 17075605 | |
| Cóctel de inhibidores de la proteasa | Roche | 11873580001 | |
| Resina Talon | Clontech 635504 | ||
| Imidazol | BioShop | 288324 | |
| Gentamicina | Gibco (Vida) | 15710064 | |
| Producción interna | |||
| policlonales Anticuerpo monoclonal 6X-His | Clontech | 631212 | |
| EQUIPMENT | |||
| Homogeneizador de onzas (apretado) | 357546 | Wheaton | |
| (desmembrador de Fisher) | Bolsa | Fisher Model 150 | |
| (50 mm) | Fisher Scientific |
Referencias
- Lichty, J. J., Malecki, J. L., Agnew, H. D., Michelson-Horowitz, D. J., Tan, S. Comparison of affinity tags for protein purification. Protein Expr. Purif. 41, 98-105 (2005).
- Thain, A., Gaston, K., Jenkins, O., Clarke, A. R. A method for the separation of GST fusion proteins from co-p....
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Reimpresiones y permisos
