La especificación de telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes

Resumen

Este procedimiento produce neuronas telencefálicas pasando a través de los puntos de control que son similares a los observados durante el desarrollo humano. Las células se dejan a diferenciarse espontáneamente, están expuestas a factores que los empujan hacia el linaje neural, están aislados, y se sembraron sobre cubreobjetos para permitir la diferenciación terminal y la maduración.

Resumen

Aquí, un procedimiento por etapas para generar eficientemente telencefálicas neuronas glutamatérgicas a partir de células madre pluripotentes (PSC) se ha descrito. El proceso de diferenciación se inicia rompiendo las PSCs humanos en terrones que redondear hacia arriba hasta formar agregados cuando las células se colocan en un cultivo en suspensión. Los agregados se hacen crecer entonces en un medio de hESC 1-4 días para permitir la diferenciación espontánea. Durante este tiempo, las células tienen la capacidad de convertirse en cualquiera de las tres capas germinales. De día 5-8, las células se colocan en un medio de inducción neural para empujarlos en el linaje neural. Alrededor de 8 días, las células se dejan adherir a placas de 6 pocillos y se diferencian durante el cual la forma células neuroepiteliales. Estas células neuroepiteliales se puede aislar a día 17. Las células entonces se puede mantener como neuroesferas hasta que estén listos para ser chapada en cubreobjetos. El uso de un medio básico sin ningún factor de caudalizing, células neuroepiteliales son specified en los precursores telencefálicas, que luego pueden diferenciarse también en dorsal progenitores telencefálicas y neuronas glutamatérgicas eficiente. En general, nuestro sistema proporciona una herramienta para generar neuronas glutamatérgicas humanos para los investigadores para estudiar el desarrollo de estas neuronas y las enfermedades que les afectan.

Introducción

Las células madre pluripotentes (PSC), incluyendo tanto las células madre embrionarias humanas (hESCs) y células madre pluripotentes inducidas (iPS), tienen la capacidad de generar cualquier tipo de célula en el cuerpo, incluyendo las neuronas ^1-3. Diferenciación dirigida de diversos subtipos neuronales de los CRP humanos es la clave para la aplicación de estas células en la medicina regenerativa. La generación de funcionales subtipos neuronales durante el desarrollo es un proceso complejo que implica la inducción de linaje neuronal, la especificación de los progenitores regionales a lo largo del eje rostro-caudal, y la diferenciación de tipos de neuronas ....

Protocolo

1. Generación de agregados humanos de células madre pluripotentes (D1-D4)

1. Las células madre pluripotentes se cultivan en fibroblastos embrionarios de ratón (MEF) alimentadores en presencia de medio suplementado con hESC factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF, 4 ng / ml). Después de 5-7 días en cultivo, cuando las colonias son grandes, pero todavía no diferenciado, que están listos para el siguiente paso.
2. La primera solución enzimática debe estar preparado. En un tubo de 50 ml, se disuelve el dispasa (o colagenasa) a 1 mg / ml de concentración en medio DMEM/F12. Ya que estas soluciones mezclar mejor cuando se calienta, se coloca el tub....

Resultados

Aquí, un protocolo para diferenciar los CRP humanos en telencefálicas neuronas glutamatérgicas a través de varios pasos críticos: la formación de agregados PSC, la inducción de células neuroepiteliales, la generación de los progenitores telencefálicas, y la diferenciación terminal de estos progenitores en neuronas telencefálicas (Figura 1) tiene han descrito. Este sistema es robusto y eficiente en la generación de los progenitores y neuronas glutamatérgicas telencefálicas. Como un ejemplo (Figur.......

Discusión

Hay varios pasos críticos durante el proceso de diferenciación neural. Es importante asegurarse de que los PSCs humanas son pluripotentes, porque de lo contrario las células que ya pueden estar sesgados hacia convertirse en un linaje no neuronal. Esto se puede confirmar mediante tinción de las PSCs humanos con anticuerpos contra marcadores de pluripotencia, tales como Oct4, Sox2, Nanog, y ^1-3 Tra-1-60. Si los CPs humanos no se adhieren muy bien después de pases ellos, inhibidor de ROCK (Y27632) se puede agreg.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Medio de águila modificado de Dulbecco con mezcla de nutrientes F12 (DMEM/F12)	Gibco	11330-032
Sustituto de suero knockout	Gibco	10828-028
L-glutamina (200 mM)	Gibco	25030
Aminoácidos no esenciales	Gibco	1140-050
2-Mercapt– etanol (14.3 M)	Sigma	M-7522
Medio neurobasal	Gibco	21103-049
N2	Gibco	17502-048
B27	Gibco	12587-010
Heparina	Sigma	H3149
Hidrobromuro de poli-L-ornitina (poliornitina)	Sigma	116K5103
Laminina (humana)	Sigma	L-6274
Laminina (ratón)	Invitrogen	23017-015
FBS	Gemini	100-106
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A-7906
Dispasa	Gibco	17105-041
Colagenasa	Invitrogen	17104-019
Accutase	Célula Innovadora Tecnologías	AT104
ROCK Inhibidor	Stemgent	04-0012
	SB431542 Stemgent	04-0010
Dorsomorphin	Stemgent	04-0024
Factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FGF2, bFGF)	Invitrogen	13256-029
Inhibidor de tripsina	Gibco	17075
0,1% gelatina	Millipore	ES-006-B
Anticuerpo Foxg1	Dr. Y. Sasai
Anticuerpo Hoxb4 (1:50)	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas	I12
Anticuerpo Pax6 (1:5000)	Estudios del Desarrollo Banco de Hibridomas	Anticuerpo PAX6
Nkx2.1 (1:200)	Chemicon	MAB5460
Anticuerpo Tbr1 (1:2000)	Chemicon	Anticuerpo AB9616
vGLUT1 (1:100)	Sistemas sinápticos	135302
Factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF)	PrepoTech Inc.	450-02
Factor neurotrófico derivado de glial (GDNF)	PrepoTech Inc.	450-10
Factor de crecimiento de insulina 1 (IGF1)	PrepoTech Inc.	100-11
AMP cíclico (cAMP)	Sigma	D-0260
Erizo sónico (SHH)	R& D	1845-SH
Tubos de 50 ml	Becton Dickinson (BD)	352098
tubos de 15 ml	BD	352097
Placas de 6 pocillos	BD	353046
Placas de 24 pocillos	BD	353047
Matraces T25 (sin tratar)Matraces	BD	353009
T75 (sin tratar)	BD	353133
Cubreobjetos	Chemiglass Life Sciences	1760-012
6 cm Placas de Petri	BD 353004
Pipetas de vidrio de 9''	Fisher	13-678-20D
Filtros Steriflip (0.22 μ M)	Millipore	SCGP00525
filtros Stericup 1.000 ml (0,22 μ M)			Millipore
(Observador A1)	Zeiss	R2625
(Hera Cell 150)Campana de	Thermo Electron Corporation
(Sterilgard III Advance)	Centrífuga The Baker Company
(5702 R)	Eppendorf