Artículo de método

Fabricación de chips de microfluidos y método para detectar la influenza

DOI:

10.3791/50325

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26 de marzo de 2013

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1Department of Mechanical Engineering, Boston University , 2Department of Biomedical Engineering, Boston University

En este artículo

Resumen

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Un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico ha sido desarrollado para su uso como un diagnóstico molecular. El chip realiza la extracción de ácido nucleico, la transcriptasa inversa y la PCR. Los métodos para fabricar y ejecutar el chip se describen.

Resumen

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Diagnósticos rápidos y eficaces desempeñan un papel importante en el control de enfermedades infecciosas al permitir la gestión eficaz del paciente y el tratamiento. Aquí, se presenta un sistema integrado de chip microfluídico termoplástico con la capacidad de amplificar el virus en pacientes nasofaríngeas (NP) frotis y aspirados. Después de cargar la muestra del paciente, el dispositivo de microfluidos secuencialmente lleva a cabo en el chip lisis celular, la purificación del ARN y otra de concentración dentro de la extracción en fase sólida (SPE), transcripción inversa (RT) y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en RT-PCR cámaras, respectivamente. Punto final de la detección se realizó usando un Bioanalyzer fuera de chip (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). Por periféricos, se utilizó una bomba de jeringa de un solo reactivo para conducir y muestras, mientras que dos calentadores de película fina se utilizaron como fuentes de calor para la RT y PCR cámaras. El chip está diseñado para ser de una sola capa y adecuado para la fabricación de alto rendimiento para reducir la fabricatien tiempo y costo. El chip microfluídico proporciona una plataforma para analizar una amplia variedad de virus y bacterias, limitado sólo por cambios en el diseño de reactivos necesarios para detectar nuevos patógenos de interés.

Introducción

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Millones de muertes han sido reportadas durante las tres pandemias de influenza en el siglo 20 1. Por otra parte, la pandemia de influenza más reciente fue declarada por la Organización Mundial de la Salud (OMS), dos en 2009, y el 1 de agosto de 2010, 18.449 muertes fueron reportadas por la OMS 3. Esta pandemia ha demostrado una vez más la elevada carga de enfermedades infecciosas, y la necesidad de una detección rápida y exacta de la gripe a activar la confirmación de la enfermedad rápidamente, la respuesta de salud pública apropiada y un tratamiento efectivo 4.

Hay varios métodos utilizados pa....

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Protocolo

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1. Chip de fabricación 12

  1. Hacer dos placas de Zeonex 690R gránulos: distribuir 8-9 gramos gránulos Zeonex uniformemente en el centro de una placa de metal, precalentar en la prensa calentada a 198 ° C durante 5 min, y luego aplicar presión lentamente a 2.500 psi durante otros 5 min. Para completar este paso, se utilizó una prensa Carver caliente.
  2. Graba en relieve el canal microfluídico en la placa con un molde de epoxi. Los detalles sobre la fabricación de moldes se describen en otra parte 12 (diseño de canal en la figura 2b): ponga una placa en el molde de epoxi; precalentarlos en la prensa calentada a 157 ....

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Resultados

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Un resultado típico se muestra en la Figura 3 para una gripe A muestra infectada lavado nasofaríngeo. Debido a las diferentes cantidades de virus de la gripe en cada muestra de paciente, la concentración final del producto de PCR puede variar. Un buen resultado debe tener bajo nivel de ruido, dos picos claros de escalera (35 y 10380 pb) y un pico de producto único en el tamaño del producto diseñado (107 pb) para la muestra positiva. Mientras que el pico del producto teóricamente debería estar ause.......

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Discusión

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El método de diagnóstico presentados aquí demuestran la capacidad de un sistema integrado de chip de plástico microfluídico para amplificar ARN influenza A partir de muestras de pacientes con alta especificidad y un bajo límite de detección 13 Se diseñó este chip para el punto de potencial de las pruebas de atención:. (A) la temperatura y fluídico el control se simplifica, (b) el chip es de bajo costo y adecuadas para la fabricación de alto rendimiento utilizando moldeo por inyección, y (c) el chip es desecha.......

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Divulgaciones

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Los autores han declarado conflictos de intereses financieros.

Agradecimientos

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Esta investigación fue financiada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) de subvención R01 EB008268.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre del reactivo / material Empresa Número de catálogo
1-dodecanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 443816-500G
2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 196118-50G
2100 Bioanalyzer Agilent Technologies, Santa Clara, CA G2943CA
2-propanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 19516
Benzofenona Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 239852-50G
BSA Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA A7979-50ML
Butil metacrilato Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 235865-100 ml
Carrier RNA Qiagen, Valencia, CA 1017647
Ciclohexanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 105899-1L
Etanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO E7023
Dimetacrilato Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 335861
Dimetacrilato de etilenglicol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 335681-100ML
Jeringa de vidrio 250 l Hamilton, Reno, NV 81127
Tiocianato de guanidina Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 50981
Kit de ADN de alta sensibilidad Agilent Technologies, Santa Clara, CA 5067-4626
Prensa caliente Carver, Wabash, IN 4386
JB Weld Epoxies Mcmaster-Carr, Elmhurst, IL 7605A11
Jeringas Luer-Lok BD-Medical, Franklin Lakes, NJ 309628
Cloruro de Magnesio Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA AB-0359
Metanol Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 494437
Metil metacrilato Sigma-Aldrich, St. Louis, MO M55909
NanoPort Upchurch Scientific N-333 a 01
NanoPort montaje Upchurch Scientific F-120x
Nucleasa libre de agua Thermo Fisher Scientific, pittsburge, PA PR-P1193
OneStep RT-PCR kit Qiagen, Valencia, CA 210210
PEG8000 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 41009
Fuente de alimentación VWR, Radnor, PA 300V
Lejos RNAsa Sigma-Aldrich, St. Louis, MO 83931-250ML
RNASecure Applied Biosystems, Foster City, CA AM7005
Las microesferas de sílice Polysciences, Warrington, PA 24324-15
Bomba de jeringa Harvard Apparatus, Holliston, MA HA2000P/10
Cinta térmicamente conductora McMaster-Carr, Elmhurst, IL 6838A11
Par termoeléctrico Omega Engineering, Stamford, CT 5SRTC-TT-J-40-36
Calentadores de película fina Minco, Minneapolis, MN HK5166R529L12A
Crosslinker Ultravioleta UPV, Upland, CA CL-1000
Zeonex Zeon Chemicals, Louisville, KY 690R

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholls, H. Pandemic Influenza: The Inside Story. PLoS Biol. 4, (2006).
  2. WHO | World now at the start of 2009 influenza pandemic. , World Health Organization. Geneva, Switzerland. Available from: http://www.who.int/mediacentre/news/statements/2009/h1n1_pandemic_phase6_20090611/en/ (2009).
  3. WHO | Pandemic (H1N1) 2009 - update 112. , World Health Organ....

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